QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法測定小麥中的8種真菌毒素

肖全偉，吳文林，劉玲利

（1.成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610100；2.成都理工大學材料與化學化工學院，成都 610059）

真菌毒素是真菌在適宜環境下生長產生的毒性次級代謝產物，對動物和人類有遺傳毒性、致癌和致畸性，同時還會引起肝腎中毒、生殖系統異常以及抑制免疫反應等，對人類身體健康造成嚴重威脅[1]，其中黃曲霉毒素屬于極毒類，被國際癌癥研究機構（IARC）劃定為一類致癌物。

真菌毒素的檢測方法主要有酶聯免疫吸附法[2-3]、氣相色譜-質譜聯用法[4-6]和液相色譜-質譜聯用法[7-9]等。酶聯免疫法檢測結果易出現假陽性，適用于真菌毒素的快速檢測；氣相色譜-質譜聯用法樣品檢測前常需衍生化處理，在一定程度上受到限制；液相色譜-質譜聯用法擁有液相色譜高效的分離技術以及質譜高分辨率的檢測能力，具有準確度高、靈敏度高、特異性和選擇性強的特點，能夠快速、有效同時測定多種真菌毒素，是目前開發在復雜基體樣品中同時測定多種真菌毒素的良好方法。目前，國內外對小麥等原糧中真菌毒素的含量高度重視，發達國家檢測標準方法中涉及真菌毒素的種類較多，且限量標準比較苛刻。我國現行的真菌毒素國家標準檢測方法常只測定單一或少數幾種真菌毒素，檢測效率較低。為此，開發建立與國際接軌的小麥等原糧中多種真菌毒素的同時檢測方法顯得十分必要。

QuEChERS技術首先由M.Anastassiades等[10]于2003年在測定蔬菜和水果中的農藥殘留時建立，現被廣泛用于動植物源性食品、土壤、化妝品、中藥等基質中的獸藥、農藥殘留或非法添加物等測定[6，9，11-16]，具有待測物回收率高、應用范圍廣、分析速度快、污染小和操作簡單等優勢。本文對QuEChERS前處理技術條件進行改進和優化，研究建立了采用HPLC-MS/MS法同時測定8種真菌毒素的高通量檢測和確證方法。

1 材料和方法

1.1 試驗儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀：日本SHIMADZU公司；API 4000 Q Trap質譜儀，配電噴霧離子源（ESI）：美國ABI公司；振蕩器：德國Heidolph公司；高速離心機：美國BECKMAN公司；N-EVAP水浴氮吹儀（美國OA公司）；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司。

1.2 試劑與試材

黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、T-2毒素（T-2）、HT-2毒素（HT-2）：購自 Trilogy Analytical Laboratory，其中 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的濃度為 25 μg/mL，T-2、HT-2 的濃度為 100 μg/mL；二乙酸熏草鐮刀菌烯醇（DAS）、赭曲霉毒素A（OTA）：購自Fermentek，純度＞99%。乙腈和甲醇（色譜純）：美國Honeywell公司；甲酸及甲酸銨（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；十八烷基硅烷鍵合相硅膠（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷鍵合相硅膠（PSA）、石墨化碳（GCB）和氨基鍵合相硅膠（NH2）均購自美國Agilent公司；硫酸鎂和氯化鈉（分析純）：成都市科龍化工試劑廠。試驗所用水均為Milli-Q超純水。所收集的15份小麥樣品均來自農戶。

分別稱取DAS和OTA固體標準品各1 mg，用乙腈配制濃度為100 μg/mL的單標準溶液，置于-18℃備用。

分別移取適量8種真菌毒素單標準溶液，用乙腈稀釋并定容，配制成混合標準溶液，于-18℃儲存。

基質匹配標準溶液：稱取不含8種待測物的小麥樣品，按1.3.2節方法操作，得到空白基質溶液。用空白基質溶液稀釋混合標準溶液配制成一系列混合基質匹配標準溶液，且現用現配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品制備

分別取有代表性的樣品500 g，四分法縮減至少100 g，粉碎，混合均勻后裝入樣品密封袋中于-18℃避光保存，防止樣品受污染和變質，以備用。

1.3.2 樣品提取與凈化

稱取2.0 g（精確至0.001 g）制備樣品于50 mL帶螺旋蓋離心管中，加入8 mL 0.3%甲酸水溶液并在高速均質器中均質30 s，振蕩15 min，加入10 mL乙腈，渦旋振搖30 min后加入1.5 g硫酸鎂和0.5 g氯化鈉固體，劇烈振搖 2 min 后，離心 3 min（5 000 r/min）。移取離心后上層有機相2 mL至另一支10 mL具塞離心管中，加入150 mg無水硫酸鎂，150 mg C18和20 mg PSA吸附劑后，旋緊螺旋蓋，立即高速渦旋混合1 min，然后于4℃下離心1 min（4 000 r/min）。離心后全部上清液于水?。?5±1）℃下氮氣吹干，以20%乙腈水溶液溶解濃縮物并定容至1.0 mL，渦旋混合 1 min后離心 5 min（15 000 r/min），留取上清液待測。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱（5 μm，150 mm×4.6 mm i.d.）；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：A-甲醇；B-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨水溶液。梯度洗脫程序見表1。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI+）；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550℃；監測方式：多反應監測方式（MRM）；8種待測物的去簇電壓（DP）及碰撞能（CE）、定性和定量離子對等質譜參數見表2。

1.4.3 樣品測定

取適量樣品溶液和相應的基質匹配工作溶液系列，分別上LC-MS/MS測定，外標法定量，若樣液中待測物濃度超出工作曲線范圍，需稀釋后再測定。

1.4.4 數據分析

回收率與精密度等數據在Microsoft Excel 2007版軟件上進行分析。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The program of gradient elution

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

分別將濃度為0.5 μg/mL的8種真菌毒素單標準溶液直接通過針泵進樣方式優化質譜條件。先在全掃描方式中優化各種真菌毒素的母離子信號，選擇信號最強的準分子離子峰作為母離子。由于串聯質譜的靈敏度較大程度上依賴于化合物在全掃描模式中的響應，因此需盡可能地優化全掃描質譜信號。然后通過選擇離子掃描模式和子離子掃描模式優化子離子、碰撞能和碰撞氣體，分別選擇豐度較大的兩個碎片離子為檢測定性子離子，其中豐度最大的為定量子離子。優化的主要質譜參數見表2。

表2 8種真菌毒素的主要質譜參數Table 2 The MS/MS parameters of 8 mycotoxins

2.2 色譜條件的優化

圖1 8種真菌毒素標準溶液的MRM色譜圖Figure 1 The MRM chromatogram of eight mycotoxins

在正離子模式下，流動相呈酸性有助于提高各種待測物在質譜中的離子化效率，為獲得最佳分辨率和靈敏度，比較甲酸水溶液和乙酸水溶液對待測物測定的效果。結果表明，在ESI+模式下，以添加0.1%甲酸的甲醇-水為流動相時的色譜分離和離子化效果較好，同時添加適量的甲酸銨有利于待測物的色譜分離。為此，本研究采用甲醇-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨水溶液為ESI+模式的流動相。優化的梯度洗脫程序見表1。8種真菌毒素的標準溶液MRM色譜圖見圖1。

2.3 QuEChERS條件優化

2.3.1 提取劑的種類及用量

QuEChERS方法中常用的提取劑有乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷等。由于原糧中水分含量較低，需加水充分浸潤混合均勻后再進行溶劑提取。在選擇提取劑時應該考慮溶劑的極性，其既能與水互溶從而滲透到樣品內部，同時通過鹽析作用后又能與水分離。乙酸乙酯作為提取劑時回收率低；丙酮、甲醇是良好的提取劑，但其共萃取物較多且不易與水分離；二氯甲烷、三氯甲烷可溶解色素，而且對人體毒性強。乙腈具有上述要求的溶劑性質，對樣品中的蛋白質、脂肪和糖的溶解性較小，提取效果好。因此，根據8種真菌毒素的性質和樣品的基質特性，選擇乙腈作為提取劑。

取一定量的陰性小麥樣品，加入已知量的8種真菌毒素標準溶液，充分混勻，制成陽性樣品。分別取2 g制備的陽性樣品，考察不同乙腈用量對8種待測物回收率的影響。試驗結果表明隨乙腈用量的增加，8種真菌毒素的回收率相應提高。當提取劑體積為8 mL時，其回收率均小于70%，未達到分析要求；當提取劑體積為10 mL時，其回收率接近90%，可滿足分析要求；當繼續增加提取劑用量時，其回收率增加不明顯。因此，考慮溶劑使用量及環保要求，確定提取劑乙腈用量為10 mL，見表3。

表3 乙腈用量試驗Table 3 Selection of the amount of acetonitrile

2.3.2 樣品水溶液中添加酸種類及用量

采用酸性水溶液浸潤樣品能使樣品保持較低pH值，進而抑制待測物的離子化使其更易溶于有機相，以達到增高提取效率和保持穩定回收率的目的。常用的酸有甲酸和乙酸，其效果相近，本試驗選用甲酸。

分別稱取2 g制備的含8種真菌毒素的小麥樣品，考察不同濃度的甲酸對其回收率的影響。試驗結果表明，隨甲酸濃度增加，8種真菌毒素的回收率變化不明顯，均在80%以上，可滿足分析要求（見表4）。為保證方法具有較強的耐受性，確定水中添加甲酸的濃度為0.3%。

表4 甲酸濃度選擇Table 4 Selection of the concentration of formic acid

2.3.3 提取時間

分別考察提取時間為 5、10、20、30、60 min 時對8種真菌毒素回收率的影響。為縮短提取時間，同時提高提取效率，試驗采用渦旋振搖提取方式。隨提取時間增加，8種真菌毒素的回收率相應提高。當提取時間為20 min時，其回收率在82.1%～89.4%之間；在30 min時，其回收率在89.5%～99.1%之間，滿足分析要求；當進一步增加提取時間時，其回收率變化均不明顯，趨于穩定（見表5）。因此，選擇合適的振搖提取時間為30 min。

表5 提取時間選擇Table 5 Selection of extraction time

2.3.4 鹽析劑的種類及用量

通過加入適量的鹽析劑使水相和有機相分層，因而引起的有機相極性變化可使極性范圍更寬的待測物進入有機相中，有效提高提取效率。QuEChERS方法中常用的鹽析劑有氯化鈉、硫酸鎂、乙酸鈉等。本研究采用的鹽析劑為0.5 g氯化鈉和1.5 g無水硫酸鎂。

2.3.5 凈化吸附劑種類及用量

QuEChERS技術中用于凈化的吸附劑主要有：十八烷基硅烷鍵合相硅膠（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷鍵合相硅膠（PSA）、石墨化碳（GCB）、氨基鍵合相硅膠（NH2）等。這幾種吸附劑具有各自的特點，也具有一定的共性。由表6可知，C18粉末作為吸附劑效果最好，本試驗初步選定C18粉末作為吸附劑，無水硫酸鎂（magnesium sulfate anhydrous，MSA）用于除去凈化樣液中少量的水分。但從凈化液顏色看還有色素雜質，會污染質譜系統，還有可能導致較嚴重的基質效應。由于小麥等原糧樣品基質較復雜，盡管PSA對待測物有不同程度的吸附，但它具有良好的除色素雜質及脂類性能，恰當地組合使用吸附劑可以達到最好的凈化效果。因此本試驗嘗試加入少量PSA，與C18粉末一起組成吸附劑組合，以期達到既不損失回收率，又能達到徹底凈化樣液的目的。通過試驗（見表7、表8），本研究選擇的吸附劑種類和用量分別為150 mg C18、20 mg PSA。

表6 吸附劑選擇Table 6 Selection of adsorbent（n=2）

表7 C18吸附劑用量選擇（n=2）Table 7 Selection of the amount of C18（n=2）

表8 PSA吸附劑用量選擇（n=2）Table 7 Selection of the amount of PSA（n=2）

此外，還對無水硫酸鎂的用量進行了考察。按“1.3.2”節進行樣品處理。加入150 mg C18粉末和25 mg PSA，再分別加 100、150、200、250、300、400 mg無水硫酸鎂于2 mL上清液中，余下按步驟操作。分別計算其回收率，試驗結果表明隨無水硫酸鎂加入量增加，回收率變化不大，但加入量超過250 mg，回收率有較明顯偏低，可能是無水硫酸鎂具有良好吸水性，用量過大導致待測物回收降低。因此本試驗選擇無水硫酸鎂加入量為150 mg。

2.4 基質效應影響

基質效應是指被分析樣品中除待測物以外的基質組分對待測物分析的干擾和測定結果準確性的影響，是由共流出物影響電噴霧接口處待測物離子化效率所致，表現為基質抑制和基質增強兩種，其中基質抑制較為多見。本研究采用標準曲線法考察基質效應（ME），將繪制得到小麥樣品的基質匹配標準曲線斜率與相應的標準曲線斜率進行比較。試驗結果表明，基質匹配標準曲線斜率小于標準曲線斜率，即存在基質抑制效應（ME：AFB10.78、AFB20.69、AFG10.81、AFG20.75、OTA 0.92、T-2 0.83、HT-2 0.78、DAS 0.82）。本方法采用空白基質匹配標準曲線進行定量，可以減小基質效應，以達到檢測分析要求。

2.5 線性關系、方法檢出限和定量限

在優化條件下用HPLC-MS/MS測定配制的系列基質匹配標準溶液，以各種真菌毒素濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，得到的線性范圍、線性方程、相關系數、方法檢出限（以S/N≥3計）和方法定量限（以 S/N≥10計）見表 9。在 0.05～200 μg/L范圍內，8種真菌毒素方法的線性關系良好，相關系數（r）均大于 0.99，方法檢出限為 0.10～1.0 μg/kg，定量限為 0.25～2.8 μg/kg。

表9 8種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限Table 9 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs and LQDs of eight mycotoxins

2.6 回收率與精密度

選用空白小麥樣品進行3個不同濃度水平（定量限、2倍定量限、5倍定量限）的8種混合真菌毒素標準加標回收試驗，在每個加標水平下分別選取6個平行樣，8種真菌毒素的平均回收率為85.1%～95.4%，相對標準偏差為3.8%～8.5%，符合痕量分析要求?；厥章逝c精密度數據見表10。

2.7 實際樣品測定

采用該方法測定了收集的15份小麥樣品，測定結果見表11。由表11可以看出，OTA、T-2毒素的檢出率較高，分別為33.3%、46.7%，含量分別為1.55～3.45 μg/kg，2.67～70.4 μg/kg。

3 討論與結論

將本試驗檢測結果與我國食品安全國家標準（GB 2761-2017）中列出的真菌毒素最大允許限量值比較（黃曲霉毒素B1≤5.0 μg/kg、赭曲霉毒素A≤5.0 μg/kg），都符合標準限量要求，表明所采集的小麥樣品受黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A等污染情況較好。結合國內相關文獻[17-18]，小麥普遍受到赤霉病菌等真菌侵染?？紤]到小麥及其制品的消費量大，下一步課題組將拓展檢測項目種類（比如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、玉米赤霉醇等），增大檢測樣品量，較全面客觀反映四川地區乃至全國內大宗糧食類的真菌毒素污染情況，以便制定切實可行的監測及防控計劃。

本文建立的小麥中8種真菌毒素檢測方法具有快速、靈敏、準確、可靠、環保等特點，補充了原糧中多種真菌毒素定量確證檢測方法，可以為原糧質量安全的管理和控制提供技術支持。

表10 小麥樣品中8種真菌毒素的加標回收率與相對標準偏差Table 10 Recoveries and RSDs for eight mycomycotoxins

表11 實際樣品測定Table 11 Determination of real samples