亞砷酸鈉對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響

陳美意，王逸琦，狄春紅，洪 玉，王 靖，金樂紅，譚曉華

(1.杭州師范大學 醫學院，浙江 杭州 310036； 2.杭州師范大學附屬醫院 檢驗科，浙江 杭州 310015)

砷是自然界廣泛存在的一種有毒的類金屬元素[1]，是確定的一類致癌物，可導致肝、肺等多種組織的癌癥，還與糖尿病、心腦血管疾病等相關[2-3]。研究發現，砷是細顆粒物PM2.5的重要成分[4-5]。砷微核試驗是化學毒物或物理因素損傷染色體、干擾細胞有絲分裂的快速檢測方法。微核是間期細胞中染色體畸變的一種表現形式，在各種理化因子，如輻射、化學藥劑作用下產生的染色單體的無著絲粒斷片或因紡錘絲受損而丟失的整個染色體，不能隨有絲分裂進入子細胞, 在細胞質中形成一個或幾個規則的次核。本研究采用小鼠骨髓微核法檢測亞砷酸鈉對微核形成的影響，為研究亞砷酸鈉(NaAsO2)的遺傳毒性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 NaAsO2(美國sigma公司)用生理鹽水配制為0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL 各濃度的溶液，環磷酰胺(天津金世制藥有限公司)用生理鹽水配制濃度為4 mg/mL的溶液。

1.2 小鼠分組及處理 選用昆明種成年小鼠，雌雄小鼠各隨機分為6 組，每組8只。采用等容量法灌胃給藥，每20 g體重小鼠灌胃0.5 mL藥物。以環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)100 mg/kg劑量組為陽性對照，以生理鹽水處理組為陰性對照。小鼠經口LD50亞砷酸鈉為50 mg/kg[6]，亞砷酸鈉處理各組劑量分別為1.5625，3.125，6.25，12.5 mg/kg，共灌胃2次，每次間隔24 h。

1.3 股骨骨髓細胞涂片制備 于第二次灌胃6 h后處死小鼠，剝離股骨，剪除兩端骨垢。每只小鼠用0.5 mL胎牛血清沖洗股骨骨髓至離心管中，800 rpm離心5 min收集骨髓細胞。吹勻后用槍頭吸取少量骨髓細胞滴至載玻片一端1/3處上，取另一張載玻片邊緣置于骨髓細胞上呈30°角，迅速推片，在酒精燈上烤干后將載玻片置于甲醇中固定15 min，晾干后于新鮮配置的吉姆薩染液中染色20 min，取出后清水沖洗掉多余染液并晾干。

1.4 鏡檢觀察計數 油鏡下觀察計數，嗜多染紅細胞(PCE)呈灰藍色，正染紅細胞(NCE)細胞呈橘黃色。計數1000個PCE，計算嗜多染紅細胞微核率(micronucleus frequency，MN‰)；計數200個紅細胞，計算PCE/NCE比值。選取兩名有經驗成員進行平行計數，取其平均數，如數值差距較大則轉換視野重新計數。

1.5 統計學方法 采用 SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對小鼠骨髓PCE微核率的影響 微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小為主核的1/20～1/4(圖1)。與生理鹽水灌胃的陰性對照組比較，雌、雄性小鼠亞砷酸鈉各處理組的骨髓PCE細胞微核率均增加，差異有統計學意義(P<0.05)；且微核率隨著砷濃度的增加而增加，呈劑量依賴效應。雌性小鼠12.5 mg/kg NaAsO2劑量組微核率為14.02±3.20‰，100 mg/kg CTX陽性對照組的微核率為14.89±0.70‰，差異無統計學意義(P>0.05)；雄性小鼠12.5 mg/kg NaAsO2組微核率為14.25±0.60‰，100 mg/kg CTX陽性對照組的微核率為15.49±0.80‰，差異無統計學意義(P>0.05)。亞砷酸鈉同劑量組間的雌、雄小鼠間微核率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 微核細胞(箭頭所示)(×100)

注：A. 雄性小鼠；B. 雌性小鼠；與生理鹽水組比較，*P<0.05；** P<0.01。圖2 亞砷酸鈉對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響

2.2 對小鼠PCE/NCE比值的影響 雌、雄性小鼠各亞砷酸鈉劑量處理組的PCE/NCE比值與生理鹽水陰性對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；相同處理雌、雄小鼠間PCE/NCE比值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。100 mg/kg CTX陽性對照組的雌性小鼠PCE/NCE比值和雄性小鼠PCE/NCE比值均低于陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

注：*與同性別生理鹽水組比較，P<0.05。圖3 亞砷酸鈉砷對小鼠骨髓PCE/NCE比值的影響

3 討論

微核是指存在于細胞中主核之外的一種核酸顆粒，是細胞內染色體斷裂或紡錘絲功能受影響在細胞有絲分裂后期滯留在細胞核外的遺傳物質。微核可以出現在多種細胞中，但在有核細胞中較難與正常核的分葉及核突出物相區別。骨髓中成紅細胞分化為紅細胞的過程中，主核排出成為PCE，細胞保持其堿性約24 h，然后成為NCE。因此計數PCE細胞中微核可以排除主核的干擾，計數更為準確。Banerjee等[7]使用瑞士白化鼠為動物模型，檢測到1.6 mg/kg三氧化二砷(As2O3)處理組小鼠骨髓PCE細胞微核率約為5‰。另有研究表明，砷可以誘導植物細胞微核率增加[8]。體外微核實驗發現，砷可以誘導人淋巴微核率的增加[9]。國外的流行病學研究數據顯示，砷暴露人群的微核率增加[10]，但國內未見相關報道。PCE為未成熟的紅細胞，而NCE為成熟紅細胞，PCE/NCE比值可以反映骨髓造血抑制情況，如比值<0.1，表示PCE形成受到嚴重抑制。本研究以昆明種成年小鼠為動物模型，檢測了不同濃度NaAsO2對小鼠微核率的影響，在劑量選擇上參考魏建宏[6]的研究報道。結果顯示，1.5625～12.5 mg/kg劑量范圍內的NaAsO2能夠顯

著增加雌、雄性小鼠骨髓PCE細胞的微核率，呈劑量依賴效應。雌、雄性小鼠各亞砷酸鈉劑量處理組的PCE/NCE比值與陰性對照組比較，差異無統計學意義。本研究結果提示亞砷酸鈉具有較強的促微核形成能力，12.5mg/kg NaAsO2劑量組的微核率與100 mg/kg CTX陽性對照組接近。

綜上，亞砷酸鈉具有較強的遺傳毒性，但其誘導產生微核的機制尚需進一步研究。