儲藏期油茶籽霉菌多樣性分析

劉 金 張立釗 陳力力 周 玥

(湖南農業大學食品科技學院1，長沙 410128)

(食品科學與生物技術湖南省重點實驗室2，長沙 410128)

油茶是生長在我國南方丘陵地區的重要木本經濟油料作物，其籽粒營養豐富，不僅含脂肪酸山茶苷、磷脂質和皂苷、維生素E、維生素D、維生素K和胡蘿卜素(即維生素A原)和鞣質，更為重要的是還含有角鯊烯成分。油茶籽油是一種油酸含量高于80%［1］的優級烹飪油，含有豐富的維生素 E、茶多酚、角鯊烯、β－谷甾醇等生物活性物質，而且不含膽固醇、芥酸等有害物質［2－3］，可以預防血管動脈粥樣硬化而引起的多種心腦血管疾?。?］。

油茶籽的采摘在每年秋季進行，一年一收，但是油茶籽油提取加工生產往往要持續一年［5］。油茶籽粒是具有生物活性的有機體，含有微生物生長的各種營養成分，是微生物的良好基質;我國南方冬春陰濕多雨，保存不當時，易造成油茶籽中霉菌生長和代謝產毒，導致對油茶籽品質和食品安全性的危害，并且在大規模儲藏的油茶籽中本身有極少數油茶籽已霉變或攜帶了霉菌，在一定的濕度和溫度環境下極易發生大范圍霉變。油茶籽霉變的實質就是油茶籽中的有機物質被微生物分解［6－8］，油茶籽霉變不僅降低了油茶籽油的營養價值以及油茶籽副產品的綜合利用價值，更重要的是霉菌在油茶籽內部和表面大量繁殖、生長，而且有些霉菌還能產生具有毒性的二級代謝產物，即真菌毒素，部分真菌毒素已被證實具有致癌、致畸、致細胞突變的作用，嚴重影響油茶籽以及油茶籽副產品的安全性。因此，研究油茶籽在儲藏過程中微生物種類及其對油茶籽及油茶籽副產品安全性的影響至關重要［9－10］。

高通量測序技術(high－throughput sequencing)具有高通量、高靈敏度、高準確性和低運行成本的特點，該測序技術已被應用于多種生態系統如海洋［11－12］、腸道［13－14］、土壤［15－16］、人類皮膚［17］等生態系統的微生物多樣性研究，它可以深入、細致地研究微生物群落結構。采用高通量測序技術對儲藏期油茶籽殼、仁污染霉菌進行了菌群多樣性分析，為進一步研究儲藏期油茶籽主要霉菌對油茶籽油的品質影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

油茶籽:廣西百色地區。

孟加拉紅培養基:北京陸橋生物技術有限公司;瓊脂糖生工生物工程(上海)股份有限公司;Plant Genomic DNA Kit試劑盒、凝膠回收試劑盒及PCR擴增試劑盒等:北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

瓊脂糖凝膠電泳儀:Bio－Rad公司;ABI Gene-Amp?9700型PCR儀:愛普拜斯公司;QuantiFluorTM－ST藍色熒光定量系統:Promega公司;Miseq儀:Illumina公司;HC－1016高速離心機:安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 取樣方式

采用棋盤式采樣法從已儲藏15個月的油茶籽中抽取30袋，每袋100 g，隨機分為5組，從每袋上層挑取霉變油茶籽20－25顆制備5個混合樣品，備用。

1.3.2 可培養霉菌菌落計數

用無菌剪刀將油茶籽殼仁分離，將油茶籽仁剪切到黃豆大小，油茶籽殼剪切到1 cm2大小，根據GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》方法，將樣品10倍梯度稀釋，分別取 10－1、10－2、10－3樣品稀釋液，采用混菌法接種孟加拉紅瓊脂培養基平板中，于28℃恒溫培養5 d，進行平板菌落計數和計算，以lg CFU/g報告結果，并采用Excel 2007進行數據統計分析。

1.3.3 樣品霉菌DNA提取及Miseq測序分析

分別收集1.3.2殼、仁10－1樣品稀釋液制備混合樣，按照Plant Genomic DNA Kit試劑盒說明書分別提取樣品霉菌基因組DNA，油茶籽殼樣品編號為1、油茶籽仁樣品編號為2，隨后采用 Dy NA Quant 200測定其純度，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行DNA完整性檢測;提取質量合格的DNA樣品，送上海美吉生物醫藥科技有限公司，采用合成的特異引物ITS1F_ITS2R(ITS1:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC)對真菌的ITS區PCR擴增，使用Illumina(MiSeq)平臺對真菌的ITS區進行核酸序列測序。

對Miseq測序得到的PE reads進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，選擇序列長度200－1 000 bp，用 Qiime軟件聚類操作將相似度大于97%的序列稱歸為同一個操作分類單元［Operational Taxonomic Units(OTU)］，基于OTU聚類分析結果，采用 mothur軟件及菌群豐度指數計算法對OTU進行群落的物種豐度和多樣性指數分析，用于指數評估的OTU相似水平97%(0.97);基于分類學信息，在不同水平上對各樣品進行群落結構的統計分析。

2 結果和分析

2.1 可培養霉菌計數

可培養霉菌計數結果見圖1，在孟加拉紅培養基上培養5 d后，油茶籽殼霉菌數量為(3.25±0.28)lg CFU/g、油茶籽仁為(2.70 ±0.49)lg CFU/g，這說明油茶籽殼可培養霉菌總數大于油茶籽仁。

圖1 油茶籽殼、仁霉菌總數計數

2.2 樣品序列分析及取樣深度驗證分析

取各樣品總DNA 2 μL加樣進行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用分光光度計檢測OD260和OD280，如圖2a所示，電泳目的條帶清晰、260/280為1.55和1.79，濃度和純度符合進行PCR擴增的要求，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，如圖2b所示目的條帶大小合適，濃度合適，滿足核酸序列測序要求。

圖2 瓊脂凝糖膠電泳檢測圖

經Miseq測序得到兩個樣品序列信息，2個樣本得到真菌有效序列769 57條，油茶籽殼有效序列為423 32，油茶籽仁有效序列為346 25。MiSeq測序得到的是雙端序列數據，首先根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接(merge)成一條序列，同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾，根據序列首尾兩端的barcode和引物序列區分樣品得到有效序列，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU，兩樣品共產生126個OTU，最終得到的測序長度在200－350 bp內，平均長度在255 bp左右，測序長度上下浮動不大，說明得到的序列是能夠應用于后續分析的。

以抽到的序列數與它們所能代表的物種數目構建稀釋性曲線，2個樣品的稀釋曲線如圖3。曲線趨于平坦，說明更多的數據量對發現新OTU的邊際貢獻很小，可進行下一步數據分析。

圖3 樣品稀釋性曲線

2.3 樣本多樣性比較分析

2.3.1 多樣性指數分析

表1中兩樣品的覆蓋率均在0.999以上，覆蓋率數值越高，樣本中序列被測出的概率就越高，由此說明測序結果代表了樣本中微生物的真實情況。多樣性指數分析表明，油茶籽殼的Chao指數及Ace指數大于油茶籽仁，在生態學中Chao 1指數和ace指數越大表示菌群豐度越高［18－19］，因此，油茶籽殼的菌群豐度高于油茶籽仁;另外，表中油茶籽仁的Shannon指數1.219 8弱小于油茶籽殼的1.258 2，而Simpson指數為0.382 5弱大于油茶籽殼的0.361 8，Shannon指數和Simpson指數是估算樣品中微生物多樣性的指數之一，Shannon值越大，Simpson指數值越小，說明群落多樣性越高［20，21］，由此可知油茶籽殼的菌群種類比油茶籽仁多。

表1 樣品多樣性指數表

2.3.2 Venn 圖分析

Venn圖可用于統計多個樣本中所共有和獨有的物種(如OTU)數目，可以比較直觀的表現樣本的物種(如OTU)數目組成相似性及重疊情況。由圖4可知，1號樣品油茶籽殼與2號樣品油茶籽分別擁有的OTU數目為69和57，而共有的OTU數為50個，重疊度較高，說明油茶籽殼、仁中的霉菌種類具有較大的相似性。

圖4 樣品OTU水平Venn圖

2.4 樣本物種比較分析

2.4.1 門水平比較分析

根據Silva的SSUrRNA序列數據庫對優化序列進行分類，門水平上兩樣品均為子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)和未分類真菌(unclassified)，雖然兩樣品所含物種門水平相同，但物種豐度存在差異，1號樣品油茶籽殼子囊菌門(Ascomycota)相對豐度大于2號樣品油茶籽仁，分別為85.06%、76.48%，擔子菌門(Basidiomycota)相對豐度小于2號樣品油茶籽仁，分別為 10.64%、18.41%。

圖5 樣本門水平比較柱形圖

2.4.2 科水平比較分析

在科水平上兩樣品均覆蓋了26個科，主要為子囊菌中的發菌科(Trichocomaceae)、毛殼菌科(Lasiosphaeriaceae)、從赤殼科(Nectriaceae)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)，擔子菌中的節擔菌科(Wallemiaceae)、粉褶菌科(Entolomataceae)以及接合菌中的被孢霉科(Mortierellaceae)等。如圖6(圖6a為1號樣品油茶籽殼，圖6b為2號樣品油茶籽仁)，對樣品物種豐度進行統計并繪制餅狀圖，圖6顯示霉菌污染油茶籽殼和仁所含物種種類相似，相對豐度最大的均為發菌科(Trichocomaceae)和節擔菌科(Wallemiaceae)，將平均豐度低于0.01%的部分合并為others，others相對豐度僅為0.04%，另外，兩樣品都有在科水平以上的未鑒定類群，分別為油茶籽殼樣品6.93%，油茶籽仁樣品6.32%。本結果說明樣本具有豐富的物種多樣性，各物種相對豐度差異明顯，同時各樣品物種復雜均存在分類不明確的類群。

圖6 樣品科水平群落餅狀圖

2.4.3 屬水平比較分析

樣品污染霉菌群落結構在屬水平上的組成見圖7，圖7中黑灰白顏色漸變，表示相對豐度逐漸增大，因此顏色的梯度及相似程度直觀地反映了各樣品同一菌屬所含序列相對豐度的相似性和差異性。由圖7可知，儲藏期油茶籽曲霉屬(Aspergillus)在1號樣品油茶籽殼中占81.51%，在2號樣品油茶籽仁中占74.50%，為主要菌屬，除該屬外，節擔菌屬(Wallemia)在油茶籽殼中占10.75%，在油茶籽仁中占18.42%，未分類真菌(unclassified k Fungi)分別為4.18%、4.95%，unclassified c Eurotiomycetes 在油茶籽殼中占2.66%，在油茶籽仁中占0.57%。而其他屬的真菌在油茶籽殼、仁中相對豐度均小于1%。

圖7 樣品屬水平群落熱圖

2.4.4 種水平比較分析

在種水平上兩樣品均覆蓋了37個種，主要為子囊菌中的帚狀曲霉(Aspergillus penicillioides)、Aspergillus cibarius、Preussia sp、Devriesia pseudoamericana、黑僵菌(Metarhizium anisopliae)，擔子菌中的蜜生節擔菌(Wallemia mellicola)以及接合菌中的Mortierella alpina等，大部分種的相對豐度均低于1%。如圖8對樣品物種豐度排在前15位的進行統計并繪制差異檢驗柱形圖，圖中顯示霉菌污染油茶籽殼和仁所含物種種類相似，相對豐度最大的均為帚狀曲霉(Aspergillus penicillioides)、Aspergillus cibarius和蜜生節擔菌(Wallemia mellicola)，但他們在油茶籽殼、油茶籽仁樣品中的相對豐度差異明顯。

圖8 樣品種水平差異檢驗柱形圖

3 討論

3.1 發菌科霉菌對油茶籽安全性的潛在影響

油茶籽中發菌科霉菌主要屬于曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)，曲霉屬(Aspergillus)被認為是3大類產毒真菌之一，能產黃曲霉毒素(aflatoxins)、赭曲霉毒素(ochratoxins)等毒素。毒性代謝產物大部分具有潛在的致癌、致畸、致突變性，以及肝臟毒性、腎臟毒性、免疫毒性、出血毒性，目前已有研究證明油茶籽在高溫、高濕環境或黃曲霉毒素孢子大量存在的條件下仍然有被黃曲霉菌感染和產生黃曲霉毒素的風險［22］，對油茶籽、油茶餅粕人為接種黃曲霉菌，雖然油茶籽和油茶餅粕中都有一定量的黃曲霉生長，但均未檢出黃曲霉毒素 B1(AFB1)［23］。同時已有研究證明某些脂氧合物可以調控曲霉屬真菌的生長、產孢和毒素合成，促進黃曲霉毒素的合成［24］。Burow 等［25］發現高濃度的 9S－HPODE 會延長黃曲霉毒素合成基因表達的時間，從而促進黃曲霉毒素合成。分子生物學和生物化學水平研究揭示了脂類物質及其氧化產物和黃曲霉毒素合成之間的密切關系［26－30］。例如，曲霉屬真菌的脂肪酸合成酶基因 fas－1A［26］，脂肪酸過氧化物酶基因 ppo A、ppo B、ppo C、ppo D［27］，脂氧合酶基因 Aflox1［28］的突變都會影響曲霉屬真菌的生長發育以及毒素合成。宿主植物的脂氧合酶基因 Zm LOX3的表達下調也可以影響曲霉屬真菌的黃曲霉毒素合成［29］。同時也有研究證明油脂水解生成的游離脂肪酸在青霉和曲霉等微生物產生的酶類催化下能進一步氧化生成酮酸和甲基麗，稱為酮型酸?。?1］，酮型酸敗中參與反應的直鏈飽和脂肪酸的碳原子數大部分為4～5個，且基本都為霉菌產生［32］。

3.2 鐮刀菌屬霉菌對油茶籽安全性的潛在影響

在分類學上，鐮刀菌屬(Fusarium)無性時期原屬于半知菌亞門，有性時期為子囊菌亞門，鐮刀菌屬又稱鐮孢霉屬，鐮孢菌毒素被認為是影響人類健康的5種真菌毒素之一。鐮孢菌一般生活在谷類作物中，它產生的毒素會殘留在作物中，有些鐮孢菌屬霉菌可以分泌單端孢霉烯族毒素，它能抑制蛋白質、PNA、DNA合成，使核糖體的一些肽鏈被切斷，破壞核糖體環;破壞膜的通透性和功能，破壞正常的造血功能，抑制免疫功能;通過血液刺激人類乳腺癌細胞的擴散和繁殖，導致動物細胞基因片段化而造成基因損傷，影響人類和動物的繁殖能力、內分泌系統及免疫力等［33］。

3.3 節擔菌屬對油茶籽安全性的潛在影響

節擔菌屬屬于擔子菌門節擔菌綱節擔菌目，節擔菌屬中的細麗外擔菌能致使油茶患上一種稱作“油茶餅病”的病害，“油茶餅病”主要發生在油茶樹的嫩葉和新梢上，但老葉和老枝上一般不發生，患病油茶通常會組織膨大，進而嫩枝葉枯死，嚴重影響油茶生長及茶果產量［34－35］。

3.4 煤炱目對油茶籽安全性的潛在影響

煤炱目是子囊菌門座囊菌綱座囊菌亞綱之下的一個多元化的目。有研究表明油茶煤污病是由山茶小煤炱菌引起的，一般對油茶不造成重大損失。腐生性的煤炱菌主要以蚧蟲、蚜蟲、粉虱等昆蟲排出的蜜露為營養來源，有時也利用寄主葉片本身的分泌物。癥狀初期，表面生黑色片狀的菌絲霉斑，似粘附一層煤煙，煤煙能抹除，抹除后枝葉表面仍為綠色。后期，霉層上散生許多黑色小粒點或剛毛狀突起，常伴生蚜蟲、粉虱和介殼蟲［36］。病害多發生在枝、葉和果實上，植物受害部位布滿黑色的煤粉層抑制植物的光合作用，削弱植物的生長勢，降低果實的感官質量，染害林果能損失10%的經濟產量［37］。因此，進一步研究儲藏期油茶籽污染霉菌所產毒素的種類及其對油茶籽及油茶籽副產品安全性的影響，對提高油茶籽加工企業的效益具有非常積極的意義。

4 結論

本研究初步分析了儲藏期油茶籽殼、仁霉菌污染的主要菌群。結果表明油茶籽殼、仁中大部分霉菌種類相同，主要有子囊菌門發菌科的曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)和鐮刀菌屬(Fusarium)，擔子菌節擔菌科中的節擔菌屬(Wallemia)，以及接合菌中的被孢菌屬(Mortierella)、毛殼菌屬(Chaetomium)。油茶籽殼中主要種為子囊菌門發菌科曲霉屬的Aspergillus cibarius和帚狀曲霉(Aspergillus penicillioides)，其次為擔子菌門節擔菌科節擔菌屬的蜜生節擔菌(wallemia mellicola);油茶籽仁中主要菌種為子囊菌門發菌科曲霉屬的帚狀曲霉(Aspergil-lus penicillioides)和Aspergillus cibarius，其次為擔子菌門節擔菌科節擔菌屬的蜜生節擔菌(wallemia mellicola)。儲藏期油茶籽的污染霉菌存在種群多樣性，油茶籽殼、油茶籽仁污染霉菌的豐度及多樣性存在相似性差異，污染霉菌種類及其產生的霉菌毒素對油茶籽及油茶籽副產品安全性的影響有待進一步研究。