羊結腸小袋纖毛蟲滋養體的消毒劑殺滅試驗

王金安，周 葉，宋開放，劉長忠，劉俊偉，姜金慶

（1. 河南科技學院動物科技學院，新鄉453003；2. 淇縣職業中等專業學校，鶴壁 456750）

結腸小袋纖毛蟲?。˙alantidiosis）是由結腸小袋纖毛蟲（Balantidium coli）引起的人畜共患寄生蟲病，呈全球性分布，已報道豬、牛、羊以及爬行類等50多種動物均可感染該病[1-3]。中國生物醫學研究中心檢測到靈長類食蟹猴結腸小袋纖毛蟲感染率達到22.2%[4]，巴西學者在圈養靈長類動物糞便中檢測到高達56.7%的結腸小袋纖毛蟲感染率[5]。結腸小袋纖毛蟲可致痢疾樣腹瀉及腸道外感染，或者與其他病原體合并感染，甚至引起腸壞死等癥狀，嚴重威脅人畜安全[6]。結腸小袋纖毛蟲生長發育分為兩個階段，即滋養體期和包囊期[7]，在寄生蟲處于滋養體時期進行殺滅可達到最佳效果。羊結腸小袋纖毛蟲病是由結腸小袋纖毛蟲寄生于羊的大腸內引起的以腹瀉、脫水、消瘦和貧血為特征的人獸共患原蟲病。豬結腸小袋纖毛蟲的研究報道較多，例如，纖毛蟲的體外培養試驗[8]、豬結腸袋蟲的分子鑒定[9]、藥物毒殺試驗[10]和理化因素影響試驗[11]等，而有關羊結腸小袋纖毛蟲的病例分析目前少見報道。本研究對羊結腸小袋纖毛蟲進行了培養，并探討各種消毒劑體外殺滅羊結腸小袋纖毛蟲滋養體的效果。

1 材料和方法

1.1 羊結腸小袋纖毛蟲的采集與處理羊結腸小袋纖毛蟲采自河南省新鄉市某杜泊綿羊養殖戶。該養殖戶共飼養100只羊，放牧散養，其中30只患嚴重腹瀉，糞便直接鏡檢發現有大量結腸小袋纖毛蟲滋養體。將陽性糞便接種于改良型RSS培養基，28℃進行增殖，達到繁殖期時，用培養基將滋養體稀釋至約3×104個/mL，制成羊結腸小袋纖毛蟲滋養體懸液備用。

1.2 改良型RSS培養基氯化鈉8 g、氯化鉀0.2 g、磷酸氫二鈉2 g、磷酸二氫鉀0.3 g溶解于滅菌蒸餾水1000 mL，使用前加入氯化鈣0.2 g、氯化鎂0.01 g，混勻備用，配制成洛克氏液（Ringer液）。適量Ringer液中，加入25%的胎牛血清，1.5%玉米淀粉和10000 U/mL的青霉素、鏈霉素，調節pH值至7.0，配制成改良型RSS培養基[11]，用于羊結腸小袋纖毛蟲滋養體的培養試驗。

1.3 消毒劑 10%高錳酸鉀溶液、5%NaOH溶液、10%硫酸銅溶液、5%戊二醛和5%福爾馬林按標準方法配制成消毒劑母液；6%84消毒液、23%過氧乙酸、新潔爾滅（5%苯扎溴銨液）、5%聚維酮碘液和來蘇兒（2.8%甲酚皂溶液）直接購買自正規生產廠家。

1.4 絕對致死濃度（lethal concentration，LC100）在96孔細胞培養板中加入改良型RSS培養基至第12孔，每孔100 μL；10%高錳酸鉀溶液100 μL，吹吸混勻后吸取100 μL至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，從第11孔棄去100 μL，留第12孔作陰性對照；每孔分別加入羊結腸小袋纖毛蟲滋養體懸液100 μL，輕輕震蕩細胞培養板，使各孔混勻，蓋上蓋板膜，28℃培養箱中作用6 h，置顯微鏡下觀察羊結腸小袋纖毛蟲滋養體的存活情況。本組試驗作3個重復。將10%高錳酸鉀溶液致羊結腸小袋纖毛蟲滋養體全部死亡的最大稀釋倍數（最小濃度），計作高錳酸鉀溶液的絕對致死濃度（LC100）。

用5%NaOH溶液、10%硫酸銅溶液、5%戊二醛、5%福爾馬林、6%84消毒液、23%過氧乙酸、5%新潔爾滅、5%聚維酮碘液和2.8%來蘇兒分別重復上述試驗。根據LC100數值選取殺菌效果最好的3種消毒劑，確定下一步試驗濃度梯度，并測算其半數致死濃度（LC50）。

1.5 半數致死濃度（LC50）試驗

1.5.1 高錳酸鉀2 h和12 h毒性試驗設計 根據預試驗結果，以10%高錳酸鉀溶液為母液，使用改良型RSS培養基對高錳酸鉀溶液進行稀釋，最終選取9個濃度梯度：0、12×10-4、14×10-4、16×10-4、18×10-4、20×10-4、22×10-4、24×10-4和12×10-4。將培養的羊結腸小袋纖毛蟲滋養體懸液混合均勻，分別加入27個10 mL容量青霉素瓶內，并補充培養基使每瓶液體體積為3 mL，然后分成9組，每組3個平行。將不同濃度的高錳酸鉀稀釋液加入相應組別的青霉素瓶內，每瓶3 mL，高錳酸鉀最終濃度（稀釋倍數）分別為：0、6×10-4、7×10-4、8×10-4、9×10-4、10×10-4、11×10-4、12×10-4和13×10-4。將青霉素瓶加蓋后置28℃恒溫培養箱內靜置培養，2 h后取出，液體充分混勻，移液器吸取10 μL滴于載玻片上，加蓋玻片后顯微鏡檢。12 h毒性試驗時，根據預試驗結果，高錳酸鉀最終濃度確定為：0、20×10-6、30×10-6、40×10-6、50×10-6、60×10-6、70×10-6、80×10-6和90×10-6，其他步驟同2 h毒性試驗。

1.5.2 福爾馬林2 h和12 h毒性試驗設計 使用改良型RSS培養基將福爾馬林母液稀釋后用于毒性試驗，具體分組和觀察方法同1.5.1。根據預試驗結果，確定2 h毒性試驗中福爾馬林最終濃度分別為：0、2×10-4、3×10-4、4×10-4、5×10-4、6×10-4、7×10-4、8×10-4和9×10-4，12 h毒性試驗中福爾馬林最終濃度分別為：0、40×10-6、50×10-6、60×10-6、70×10-6、80×10-6、90×10-6、100×10-6和110×10-6，其他步驟同高錳酸鉀毒性試驗。

1.5.3 NaOH 2 h和12 h毒性試驗設計 使用改良型RSS培養基將NaOH母液稀釋后用于毒性試驗，具體分組和觀察方法同1.5.1。根據預試驗結果，確定2 h毒性試驗中NaOH的最終濃度分別為：0、8×10-4、9×10-4、10×10-4、11×10-4、12×10-4、13×10-4、14×10-4和15 ×10-4，12 h毒性試驗的最終濃度分別為0、60×10-6、70×10-6、80×10-6、90×10-6、100×10-6、110×10-6、120×10-6和130×10-6，其他步驟同高錳酸鉀毒性試驗。

1.6 數據計算

1.6.1 滋養體存活性判定 將載玻片置顯微鏡100倍暗視野下檢查，計算30個視野下樣品的蟲體平均密度。蟲體運動減弱，原地緩慢旋轉、纖毛小幅度擺動者仍作活蟲計數；蟲體不運動，表膜脫出、萎縮、裂解或結構破碎者，作死蟲計數。

1.6.2 死亡率 以對照組（消毒劑濃度為0）3個平行樣品試驗結束時所獲得的平均活蟲數為X，以該試驗系列相應濃度組3個平行樣品試驗結束時所獲得的平均活蟲數為Y，將（X—Y）/X的數值換算成百分數，就是該濃度條件下的羊結腸小袋纖毛蟲滋養體的死亡率。

1.6.3 半數致死濃度（LC50）的計算 采用機率單位法計算LC50值，根據死亡百分率—機率單位換算表，將不同濃度下死亡百分率換算成死亡機率單位[10]。以橫軸表示濃度對數，以縱軸表示死亡機率單位，作XY散點圖，順著所獲得的散點作一趨勢線，并自動獲得該直線的回歸方程。經x2檢驗回歸線符合要求后，利用該方程式求出死亡機率單位5（50%死亡率）時的藥物濃度對數，查反對數表就可以獲得LC50值。

2 結果與討論

2.1 羊結腸小袋纖毛蟲滋養體對消毒劑的敏感性試驗結果羊結腸小袋纖毛蟲滋養體對消毒劑的敏感性結果見表1。高錳酸鉀、福爾馬林、NaOH、戊二醛、硫酸銅、過氧乙酸、聚維酮碘、新潔爾滅、來蘇兒和84消毒液對羊結腸小袋纖毛蟲滋養體的絕對致死濃度（LC100，6h）分別為：1:2056、1:1024、1: 1024、1:512、1:256、1:256、1:128、1:128、1:64和1:64，這表明常用消毒劑均可在體外環境中殺死羊結腸小袋纖毛蟲滋養體，其中高錳酸鉀、福爾馬林和NaOH殺蟲效果最好。

表1 羊結腸小袋纖毛蟲滋養體對消毒劑的6 h敏感性試驗結果Table 1 Sensitivity test results of the disinfectants on trophozoite of sheep Balantidium coli

將消毒劑放在平底96孔細胞培養板上進行倍比稀釋，然后加入等量培養的結腸小袋纖毛蟲滋養體懸液，28℃作用6 h，顯微鏡下觀察結果，測定消毒劑對結腸小袋纖毛蟲滋養體的絕對致死濃度（LC100），該方法簡便、快捷、直觀和實用。臨床上也可直接將新鮮糞便加液體培養基攪勻，糞網篩過濾，必要時進行離心濃集滋養體，制成結腸小袋纖毛蟲滋養體懸液進行試驗，以選出高效消毒劑，指導獸醫臨床進行環境消毒和疫病防控。

2.2 高錳酸鉀毒性試驗結果2 h毒性試驗的的回歸方程式為Y=3.477X-5.191，R2=0.984，回歸線符合要求，死亡機率單位為5時對應的濃度對數值為2.931，查反對數表得其濃度為853.1×10-6，即8.531×10-4，見圖1A；12 h毒性試驗的的回歸方程式為Y=1.184X+3.187，R2=0.991，回歸線符合要求，死亡機率單位為5時對應的濃度對數值為1.813，查反對數表得其濃度為65.02×10-6，即6.502×10-5（圖1B）。本研究參考豬結腸小袋纖毛蟲毒性試驗方法[12]，建立了針對羊結腸小袋纖毛蟲滋養體體外消毒劑半數致死濃度（LC50）的測定方法。結果顯示，高錳酸鉀的2 h半數致死濃度（LC50）為8.531×10-4，12 h半數致死濃度（LC50）分別為6.502×10-5。12 h半數致死濃度數據顯示中高錳酸鉀效果最好。高錳酸鉀通過氧化蟲體的活性基因而發揮殺滅作用，其突出特點是無異味，價格低廉，無毒副作用且使用方便，故可作為料槽、水槽、動物體表消毒的首選。

圖1 高錳酸鉀的濃度對數-羊結腸小袋纖毛蟲滋養體死亡機率單位曲線Fig.1 The relationship of potassium permanganate logarithm concentration-Balantidium coli trophozoite death probability unit curve

2.3 福爾馬林毒性試驗結果福爾馬林2 h毒性試驗的的回歸方程式為Y=2.882X-2.561，R2=0.988，回歸線符合要求，死亡機率單位為5時對應的濃度對數值為2.624，查反對數表得其濃度為421.3×10-6，即4.213×10-4，見圖2A；12 h毒性試驗的的回歸方程式為Y=1.815X+1.521，R2=0.993，回歸線符合要求，死亡機率單位為5時對應的濃度對數值為1.917，查反對數表得其濃度為82.67×10-6，即8.267×10-5，見圖2B。結果顯示，福爾馬林的2 h半數致死濃度（LC50,2h）為4.213×10-4，12 h半數致死濃度（LC50,12h）為8.267×10-5，即2 h半數致死消毒劑中福爾馬林效果最好。福爾馬林有強烈的刺鼻性氣味，但其2h半數致死濃度較低，因此進行體外消毒，不會對人和動物造成很大傷害。

圖2 福爾馬林的濃度對數-羊結腸小袋纖毛蟲滋養體死亡機率單位曲線Fig.2 The relationship of formalin logarithm concentration- Balantidium coli trophozoite death probability unit curve

2.4 NaOH 2 h和12 h毒性試驗結果NaOH的濃度對數與死亡機率單位呈線性關系（圖5）。2 h毒性試驗的的回歸方程式為Y≒6.789X-15.51，R2≒0.990，回歸線符合要求，死亡機率單位為5時對應的濃度對數值為3.021，查反對數表得其濃度為1050×10-6，即10.50×10-4。12h毒性試驗的的回歸方程式為Y=2.357X+0.255，R2=0.992，其回歸線符合要求，死亡機率單位為5時對應的濃度對數值為2.013，查反對數表得其濃度為103.1×10-6，即10.31×10-5。從試驗結果來看，NaOH的2 h半數致死濃度（LC50,2h）為10.50×10-4，12 h半數致死濃度（LC50,12h）為10.31×10-5，NaOH對結腸小袋纖毛蟲的半數致死濃度比前兩種消毒劑高一個數量級，但其無刺激性氣味，可作為空圈舍和潔凈地面的消毒劑。臨床應用過程中，還可以根據羊結腸小袋纖毛蟲滋養體的半數致死濃度，合理選擇消毒劑種類、劑量和用藥間隔時間，以達到最佳的防控效果。

圖3 NaOH濃度對數-羊結腸小袋纖毛蟲滋養體死亡機率單位曲線Fig.3 The relationship of NaOH logarithm concentration-Balantidium coli trophozoite death probability unit curve