一株耐酸SRB的分離及其脫硫除鎘性能

王繼勇,肖 挺,何 偉

一株耐酸SRB的分離及其脫硫除鎘性能

王繼勇*,肖 挺,何 偉

(武漢理工大學化學化工與生命科學學院,湖北 武漢 430070)

為減輕酸性礦山廢水引起的環境污染,為礦山廢水處理提供潛在的菌種資源,從土壤中分離出一株耐酸的硫酸鹽還原菌SRB1并探討了該菌株的還原硫酸鹽和除鎘特性.結果表明該菌株具有較強的脫硫除鎘能力,其最低耐受pH值,最適溫度,最大耐Cd2+濃度分別為3.7,35℃和40mg/L.在COD/SO42-32,Cd2+濃度￡30mg/L條件下,除鎘率可達99%以上.在高濃度Cd2+和SO42-的體系中,該菌對Cd2+有較強的吸附作用,能將Cd2+從50mg/L降至15.5mg/L,吸附率達58 %,采用二次培養能將SO42-從1.5g/L降至0.04g/L,脫硫率達97.3%,Cd2+濃度幾乎降為零.TEM、FTIR、SEM表征顯示,在鎘脅迫下,該菌株的細胞形態發生改變,吸附前后,紅外吸收峰改變明顯,沉淀顆粒含有結晶CdS.

硫酸鹽還原菌；酸性礦山廢水；脫硫除鎘

因礦山的開采排放出大量危害性大、污染面積廣的酸性礦山廢水(AMD),AMD中SO42-濃度較高,呈較強酸性,pH值在3.0~4.0,且還含有大量的銅、鎘、鉻、鐵等重金屬離子[1-2],而鎘作為一種毒性較強的重金屬,已被國際癌癥研究機構列為第一類致癌物質.AMD不能直接循環利用,若排入水體環境,會使水體pH值改變,破壞水體生態系統,進而降低水體自凈能力[3-4];重金屬離子會毒化土壤,影響植被生長,對環境造成巨大的危害,因此成為世界各國環境工作者面臨亟需解決的重大問題.

目前研究AMD的治理技術有吸附法、中和法、人工濕地法、微生物法等,生物法因其具有成本低、效果好等優點,且以硫酸鹽還原菌(SRB) 為代表的生物法作為一項新的實用技術而備受青睞[5-6].在厭氧條件下,利用SRB將硫酸鹽還原為H2S,溶解態的S2-與廢水中的重金屬離子反應生成溶解度低的金屬硫化物沉淀[7-8].

然而,SRB處理AMD存在缺乏廉價有機碳氮源、菌株耐酸性較差、需較高厭氧條件等問題,使得實際應用困難.為解決碳氮源問題,顧風云[4]以廉價的大豆粕發酵液為培養基氮源培養SRB菌液處理模擬AMD,SO42-、Fe2+、Cu2+等指標均能達到排放標準;肖利萍等[9]運用生活污水、雞糞和鋸末混合物發酵液作為新型有機碳源馴化SRB使SO42-去除率可達90%以上;李寧[5]先用城市生活污水稀釋AMD避免了SRB耐酸性差的缺點,再用SRB處理,硫酸根去除率可達82.6%,各金屬離子均有較高去除率.

目前耐酸性SRB菌株少有報到,且SRB在酸性環境難生存、處理效率低、效果差,為此本研究從土壤樣品中通過耐酸性馴化分離出一株耐酸性SRB,以脫硫除鎘率作為考察指標,對其進行單因素實驗、吸附、沉淀實驗,均得到較好的實驗結果,為其實際應用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 土壤來源

土壤樣品來自武漢理工大學某花壇.

1.2 培養基及檢測方法

1.2.1 培養基 液體培養基: K2HPO40.5g, NH4Cl 1.0g, Na2SO42.22g, CaCl20.05g, MgCl2·6H2O 0.05g,乳酸鈉4.56g,CdCl2(1g/L) 1.5mL,將上述試劑配制成1L溶液,121℃高壓滅菌20min,冷卻后再加入經過除菌的硫酸亞鐵0.1g,抗壞血酸0.2g.

固體培養基: 在液體培養基中加入2% (質量/體積)瓊脂且不加CdCl2.

實驗中用到的試劑均為分析純.

儀器:A360型紫外-可見分光光度計(上海翱藝儀器有限公司);pH10S-E筆式酸度計(上海精密儀器儀表有限公司);ORP-422型氧化還原電位測定儀(上?？祪x儀器);JSM-IT300型場發射掃描電子顯微鏡(SEM)系統(日本電子株式會社);JEM-2100型高分辨透射電子顯微鏡(美國Gatan);D8Adwance 型多功能X射線衍射儀(德國布魯克AXS公司); Nicolet6-700型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo電子科學儀器公司)等.

1.2.2 檢測方法 pH值、氧化還原電位(ORP)分別采用pH值計、ORP儀測量,SO42-濃度采用鉻酸鋇分光光度法測定[10],化學需氧量(COD)采用重鉻酸鉀氧化法[10],Cd2+濃度采用沈昱等[11]提出的方法測定.最后結果均為3個平行的平均值.

1.3 實驗方法

1.3.1 耐酸菌株的富集、馴化及分離 稱取5g土壤樣品至裝有100mL無菌水和玻璃珠的錐形瓶中,充分振蕩后靜置2h,取其上清液5mL接種于裝有150mL液體培養基(pH值調至6.0~6.5)的厭氧瓶中,于35℃,95r/min恒溫培養箱中培養,直到培養基完全變黑,并用濕潤的醋酸鉛試紙檢測有H2S生成,說明培養基中已富集大量的SRB.依次轉接入更低pH值梯度的液體培養基中,進行菌株的耐酸性馴化至耐pH值為3.5~4.0.然后采用稀釋涂布-疊皿夾層培養法[12]進行厭氧分離培養,待長出黑色單菌落,挑取單菌落轉入液體培養.交替進行稀釋涂布、夾層培養、挑取單菌落液體培養等操作純化多次,便可獲得一株純SRB菌株[13].

1.3.2 耐酸菌株的生長特性研究 (1)生長曲線的測定及生長過程pH值、ORP、SO42-、Cd2+的變化曲線:以不接菌的液體培養基為對照,每隔6h測定接種液的OD600、pH值、ORP、SO42-、Cd2+.以培養時間為橫坐標,繪制生長曲線及變化曲線.

(2)不同培養條件對菌株脫硫除鎘率的影響:將菌株接種于含Cd2+10mg/L,pH值為3.7的液體培養基的厭氧瓶中;分別置于20,25,30,35,40℃,95r/min恒溫培養箱中培養以考察溫度影響;保持Na2SO4質量不變,改變乳酸鈉的質量,調節溶液碳硫比(COD/ SO42-)分別為0.5,1,2,3,4,于35℃,95r/min恒溫培養箱中培養以考察碳硫比影響;用CdCl2(1g/L)分別調節Cd2+濃度為10,20,30,40,50mg/L,于35℃,95r/min恒溫培養箱中培養以考察Cd2+濃度影響.接種量均為2%,液體培養基均為150mL,分別在0h和60h取樣,以未接種的液體培養基作空白對照,測定SO42-及Cd2+的濃度,再計算出脫硫除鎘率.

1.3.3 耐酸菌株的除鎘作用研究 (1)SRB對Cd2+的吸附作用: 將培養至對數生長期的150mL菌懸液10000r/min離心15min,去上清液,用無菌水洗滌2~3次,離心,去上清液,菌體沉淀溶于30mL無菌水中,得到高濃度菌懸液.取20mL置于預處理后的3500Da透析袋中,置于初始Cd2+50mg/L、pH值為4.0的250mL溶液中,35℃恒溫磁力攪拌,用20ml無菌水加入透析袋做空白對照,不定時測定Cd2+的濃度.

(2)SRB對Cd2+的沉淀作用:以2%接種量將菌株接種于裝有含Cd2+25mg/L、SO42-1500mg/L的150mL液體培養基(pH值為4.0)的厭氧瓶中,調節溶液碳硫比為2,于35℃,95r/min恒溫培養箱中培養,以未接種的液體培養基作空白對照,不定時測定SO42-、Cd2+的濃度.

數據采用Excel 2003或Origin 9處理并繪圖,各值以3個平行實驗的平均值形式給出,且標有誤差線.

2 結果與討論

2.1 耐酸性SRB菌株的分離

通過多次馴化培養和分離純化,分離出一株耐酸性的硫酸鹽還原菌,命名為SRB1,其最低耐受pH值為3.7.在固體培養基中,35℃恒溫培養48h后長出菌落,為圓形小菌落,直徑2~3mm,固體培養基中含Fe2+時為黑色,無Fe2+存在時為濕潤透明狀.在TEM下該菌體形態為短棒狀,細胞大小約為0.5μm′1μm.

2.2 菌株的生長曲線

在菌株SRB1培養過程中,前12h菌株生長緩慢,此時菌株要適應酸性及含Cd2+環境,12~50h為對數生長期,50~66h為穩定期,OD600維持在0.44左右,66h后開始步入衰亡期.隨著菌株的生長,溶解在培養基內的H2S含量增高,當沉淀完Cd2+后,剩余的H2S會嚴重抑制菌株的生長,這與羅容珺等[14]的研究結果類似.

2.3 菌株生長過程pH值、ORP、SO42-、Cd2+的變化曲線

圖1 SRB1生長過程中pH值和ORP變化

圖1所示,培養過程中pH值隨著菌株生長能達到最大值4.5而后降低.在SRB的異化硫酸鹽還原作用下,硫酸鹽被還原為S2-,而S2-又會結合H+生成H2S[15],從而使培養基中pH值升高.在厭氧環境下,多余的H2S又會溶解于培養基中使pH值降低.ORP隨著菌株的生長持續降低,60h后穩定在-320mV左右,由于S2-,HS-與H+結合生成反應的終產物H2S,使體系的氧化還原電位下降[8],不少學者研究表明[4-6],硫酸鹽還原菌厭氧培養時所用培養基的ORP要求在-100mV以下.

SRB生長過程要消耗SO42-,生成的S2-能結合Cd2+形成硫化鎘沉淀,從而達到脫硫除鎘的目的.由圖2知,在10mg/L的Cd2+濃度下,SRB1能很好的生長,SO42-從1.5g/L降至0.55g/L,脫硫率超過60%,而Cd2+基本將為0,除鎘率約100%.在SRB還原硫酸鹽過程中,隨著培養基中碳源的消耗,且該過程產生的H2S、HS-、S2-對細菌有毒害作用,因而未將SO42-降解完全.

圖2 SRB1生長過程SO42-、Cd2+濃度變化曲線

在SRB1的對數生長期,有機物含量豐富,生存環境適宜,pH值、ORP也比較適宜其生長,所以SO42-和Cd2+去除效率也快,此時SRB1的活性最高,因而后續實驗采用該時期的菌懸液轉接.培養60h后,SO42-和Cd2+濃度基本穩定,因而此時檢測其濃度最為合適.

2.4 溫度對菌株脫硫除鎘率的影響

溫度是影響硫酸鹽還原的重要環境因素,它直接決定SRB的生長速度和代謝活性[16].如表1示,溫度在30~40℃時,SRB1有較高的脫硫除鎘率,35℃時達到最高,分別為55.3%和100%,是其生長的最適溫度.溫度低于30℃時,脫硫率低于10%,除鎘率低于15%,因而SRB1屬于中溫菌.目前研究報道的SRB大多為中溫菌,一般適合在28~38℃左右生長,臨界濕度是45℃[2].低溫會影響細胞中蛋白質的調控方式和功能,而高溫可使酶失活,都會影響SRB的正常生理代謝.

2.5 碳硫比對菌株脫硫除鎘率的影響

COD/SO42-影響SRB分解代謝過程,只有足夠的碳源才能產生足夠的ATP來進行還原.表1所示,COD/SO42-32時,處理效果好,脫硫率達55 %以上,除鎘率相應較高,而COD/SO42-<2時,脫硫除鎘率均有下降,分析原因有:一是一些學者[4,9]認為,由于還原SO42-過程在細胞內,COD和SO42-要滲透到細胞體內才能進行SO42-還原,而它們的滲透能力不同,當COD/SO42-值體外高于體內并增大時,SO42-的去除率也相應增大,從而使Cd2+除去也增大;二是碳源較低時,必然會使菌株還原力不足,影響其脫硫除鎘效率.而從經濟上考慮,COD/SO42-為2時較為合適.

2.6 初始Cd2+濃度對菌株脫硫除鎘率的影響

SRB雖然能去除Cd2+,但較高Cd2+濃度對其生長和代謝活性有抑制作用.表1所示,當Cd2+￡30mg/ L時,SRB1有較高的脫硫除鎘率,脫硫率達最高達55.4%,當Cd2+>30mg/L時,脫硫除鎘效果明顯變差,太高的Cd2+濃度有毒害作用,影響菌株的生長,SRB1的最大耐鎘濃度為40mg/L,當Cd2+達到50mg/L時,SRB1基本不能生長,脫硫除鎘率均小于3%,因此高濃度鎘廢水需重新研究方法或提高SRB1對鎘的耐受性.

研究學者也對其他重金屬做過研究,Oliver等[17]發現金屬對SRB抑制順序為Cu>Cd>Ni>Zn>Cr>Pb,抑制濃度分別為20,20,20,25,60,75mg/L.趙陽國[18]發現Fe3+使硫酸鹽去除率降至20%.AMD中不乏有其他重金屬離子,所以在實際廢水處理中要比實驗室處理困難很多,研究其他重金屬離子對SRB1的耐受性也至關重要.

表1 不同培養條件對SRB1脫硫除鎘率的影響

2.7 SRB1對Cd2+的吸附作用

當Cd2+濃度大于30mg/L時,SRB1的脫硫除鎘率降低,因為重金屬鎘會抑制細菌的生長,從而抑制其新陳代謝,阻礙SO42-的還原.為了解決SRB1在高濃度Cd2+中不能發揮其除鎘能力的問題,在此研究SRB1對高濃度Cd2+的吸附作用,在吸附過程中, SRB1雖不能進行新陳代謝,但其能通過多種途徑將Cd2+吸附在其細胞表面,結果如圖3示,Cd2+從50mg/L降低并穩定在15.5mg/L,扣除空白對照,SRB1共吸附Cd2+濃度為29mg/L,吸附率達58%,實現對Cd2+較好的吸附去除,這也說明了活細胞內積累重金屬離子的能力是有限度的. 羅麗卉等[19]利用SRB2產生的EPS吸附Cu2+,24h去除率為38%.

吸附Cd2+降低到15.5mg/L后,在SRB1的耐鎘范圍,可通過新陳代謝去除,為高濃度Cd2+的去除提高實驗依據,即先通過細胞吸附使Cd2+降低到SRB1的耐鎘范圍,再進行細菌培養進一步除鎘.

許多學者研究表明,SRB細胞表面有氨基、羧基、羥基和磷?；入娯撔曰鶊F[20],這些基團能與金屬離子發生配位絡合,從而除去重金屬離子.圖4是吸附Cd2+前后SRB1的紅外光譜變化情況,在3411cm-1的強寬峰是典型的締合羥基,它能以某種程度的氫鍵結合于酰胺中的N—H,此強寬峰也可能反映了酰胺中N—H的伸縮振動;1692cm-1處的吸收峰為羰基吸收峰;1402cm-1是羧酸陰離子(羧酸酯)的對稱振動峰;1152cm-1是糖類C—O—C的伸縮振動峰,上述結果反映了SRB1細胞上鑲嵌著眾多蛋白質和多糖的官能團,如羥基、酰胺和羰基等.

圖3 SRB1吸附Cd2+過程濃度變化

SRB1吸附Cd2+后,紅外譜圖的變化主要有以下4個方面: (1)表征羥基的振動峰發生位移(從3411cm-1變化到3378cm-1)直至消失,可推斷出羥基基團在Cd2+吸附中發揮了非常重要的作用; (2)1692cm-1處的羰基吸收峰強度逐漸減弱,說明C=O 官能團與Cd2+可能發生了配位作用;(3) 1402cm-1羧酸陰離子的對稱振動峰強度也發生較大變化;(4)1152cm-1處表征糖的C—O的振動峰位置由1152cm-1移至1163cm-1,說明糖中的伯醇基團參與Cd2+的絡合.因而吸附過程中起主要作用的是—OH、C—O—C和C=O等基團,當吸附平衡后,菌體發生聚沉,導致吸收峰減弱直至消失.許多文獻報道,這些活性基團在金屬生物吸附中發揮重要作用,如—OH和C—O—C是煙曲霉吸附Pb2+的主要吸附位[21];C=O則是紅酵母對Ag+吸附的主要位點[22].

圖4 SRB1吸附Cd2+前后紅外光譜圖

2.8 SRB1對Cd2+的沉淀作用

圖5 SRB1沉淀Cd2+過程濃度變化

在含25mg/L Cd2+的培養基中,SRB1能完成新陳代謝過程,SO42-從1.5g/L降至0.56g/L,脫硫率達63%,而Cd2+基本降為0,達到理想去除狀態.為進一步去除SO42-,將其中一瓶培養60h后的菌液進行二次培養,即將厭氧瓶敞口,然后進行高溫滅菌,無菌環境中冷卻后加2g乳酸鈉、0.1g抗壞血酸,再以2%接種量接種,培養條件不變.通過二次培養,SO42-從0.56g/L降至0.04g/L,總脫硫率達97.3%,實現了SO42-的深度去除.

SRB1在此過程中的形態和形成的沉淀表征如圖6所示,在TEM下,SRB1已經完全變形,被Cd2+脅迫成無規則狀,沉淀由細菌細胞與橢球形小顆粒均勻包裹而成.在細菌表面包裹有大小不一的橢球形顆粒,且團聚現象明顯.這種現象的原因可能是: SRB1細胞表面的羥基、酰胺和羰基等官能團先吸附Cd2+,且在細胞壁上的Cd2+離子作為有效結晶位點與SRB1新陳代謝產生的S2-、OH-反應形成CdS、Cd(OH)2沉淀;由于不同結合位點的Cd2+含量不同,使橢球形顆粒粒徑和相互間團聚程度也不同,最終形成了圖中所示形狀.

圖6 鎘脅迫下菌體形態及沉淀形狀

為確定沉淀組成,對其進行X射線衍射分析(XRD),所得圖譜見圖7,特征峰2θ為26.3°、44.0°和52.2°,查詢XRD標準譜圖進行對比后分別對應的晶面為(111)、(220)和(311),而沉淀的2θ吸收峰與標準譜圖中的吸收峰值基本吻合且在特定位置衍射峰尖銳,說明沉淀中含有結晶度較好的CdS,但是有些峰已經被弱化或發生的漂移,說明其他雜質也較多,如Cd(OH)2等.

由于AMD成分復雜,pH值較低,重金屬種類多且濃度高,目前處理AMD的過程中,都是先加入石灰中和酸以調節pH值,使環境能適合SRB的生長,這樣會帶來二次污染[1,2];有學者也通過改進處理工藝、反應器來提高處理效果,這都導致處理成本增加.本文馴化分離出的耐酸性SBR1,其耐鎘能力也比較強,在實驗室小試階段,采用間歇厭氧掛膜反應器對模擬廢水進行處理,初始硫酸根濃度為1.5g/L,Cd2+濃度為25mg/L,35℃恒溫,轉速為95r/min,培養60h后能達到與實驗初期類似的效果,脫硫率達50%,除鎘率達99%.

圖7 沉淀XRD圖譜

在實驗結果的基礎上,對于比較理想的條件,可以采用直接添加菌劑的方法處理AMD;對于高濃度的重金屬環境,可以采用先吸附再沉淀的方法,即將已在對數生在期的SRB1(可以是在處理過程中剩余的菌液)進行固定化處理,投入到AMD中進行前期吸附使重金屬離子濃度降低到一定值,能避免SRB耐酸性差、需較高厭氧條件等問題,再投加SBR1菌劑進行后續處理;對于高濃度的硫酸根廢水,可以采用多次處理的方法逐步脫硫.其中的碳源可以是含淀粉較高的廢棄植物或農作物,因為在碳源實驗中也證實了SRB1能利用淀粉,可有效解決缺乏廉價有機碳氮源的問題.

3 結論

3.1 將土壤樣品經耐酸性馴化分離出一株耐酸性硫酸鹽還原菌SRB1,可在pH值為3.7條件下生長,菌落為小圓形,TEM下形態為短棒狀.

3.2 SRB1生長過程中,pH值可升至4.5,ORP持續降低至-320mV并保持穩定;在最適條件下,脫硫率達55%以上,除鎘率達99%以上.

3.3 在實驗條件下,SRB1對Cd2+有較好的吸附性,吸附量可達29mg/L,吸附率達58%,FTIR顯示吸附前后,羥基、酰胺和羰基等吸收峰均有明顯變化.

3.4 SRB1進行二次培養可將SO42-深度去除,最終降至0.04g/L,脫硫率達97.3%;SRB1代謝過程與Cd2+形成的沉淀成分復雜,含結晶CdS.

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Isolation and characterization of an acid-resistance SRB strain with the efficient of desulfurization and cadmium-removal.

WANG Ji-yong*, XIAO Ting, HE Wei

(Wuhan University of Technology, School of Chemistry and Life Science, Wuhan 430070, China)., 2018,38(11)：4255~4260

In order to reduce the environmental pollution caused by acid mine drainage,and provide potential microbiology resources for mine drainage treatment, an acid tolerant sulfate educing bacteria strain SRB1was isolated from soil,and its characterization of reducing sulfate and cadmium removal were discussed. The results showed that the strain had high desulfurization and cadmium removal potential, and its lowest tolerant pH value, optimum temperature and maximum Cd2+concentration were 3.7, 35°C and 40mg/L, respectively. Under the condition of COD/SO42-32, Cd2+concentration￡30mg/L, the cadmium removal rate can reach more than 99%. In the high concentration of Cd2+and SO42-system, the strain had strong adsorption on Cd2+, Cd2+can be decreased from 50mg/L to 15.5mg/L, the adsorption rate reached 58%. Using secondary culturing SO42-might be reduced from 1.5g/L to 0.04g/L, the desulfurization rate reached 97.3%, and the Cd2+concentration almost decreased to 0. TEM, FTIR, SEM characterization showed that the cell morphology of the strain was changed under cadmium stress, the infrared absorption peak was changed obviously before and after adsorption, and the precipitated particles contained crystalline CdS.

sulfate reducing bacteria；acid mine drainage；desulfurization and cadmium removal

X172,Q939.9

A

1000-6923(2018)11-4255-06

王繼勇(1966-),男,湖北松滋人,副教授,碩士,研究方向為土壤重金屬污染修復.發表論文11篇.

2018-04-03

國家自然科學基金資助項目(46120511)

* 責任作者, 副教授, wangjiyong66@sina.com