林可霉素菌渣堆肥抗生素抗性基因變化分析

任省濤,郭夏麗,蘆阿虔,張倩倩,郭笑盈,王 巖*,王連忠,張寶寶

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林可霉素菌渣堆肥抗生素抗性基因變化分析

任省濤1,郭夏麗1,蘆阿虔1,張倩倩1,郭笑盈1,王 巖1*,王連忠2,張寶寶2

(1.鄭州大學化工與能源學院,河南 鄭州 450001；2.河南省新鄉華星制藥廠,河南 新鄉 453731)

為了研究抗生素菌渣堆肥過程中抗生素抗性基因(ARGs)的變化情況,以林可霉素菌渣-糠醛渣堆肥為研究對象,以污泥-糠醛渣堆肥為對照.運用熒光定量PCR技術檢測到了堆肥過程中-01、1、、、等5種林可霉素抗性基因和整合子基因1的變化情況.結果表明,堆肥化處理可以降解99%的林可霉素殘留,兩者堆肥ARGs總量絕對豐度均有較大增加,而相對豐度降低5%~22%.同時發現林可霉素菌渣堆肥有助于1的富集,表明林可霉素菌渣堆肥存在生態風險.冗余分析顯示, ARGs變化受環境因子影響嚴重,影響順序為pH值>林可霉素殘留>溫度>C/N.

堆肥；抗生素；林可霉素菌渣；熒光定量PCR；ARGs

隨著抗生素藥物的長期濫用,大量耐藥性細菌,甚至超級細菌事件層出不窮.抗生素及導致的抗生素抗性基因(ARGs)問題越來越引起關注[1-3].耐藥菌甚至超級細菌的背后其實是ARGs的快速蔓延和急劇傳播.河流、土壤、畜禽糞便、凍土、蔬菜、奶制品、肉制品等均檢測到不同種類不同豐度的ARGs存在,ARGs污染正在越來越多的影響人類健康[5-13].

中國已經成為全球抗生素第一大生產國,據統計2013年中國抗生素總產量高達24.8萬t,約占世界的2/3[14].抗生素生產過程中產生的抗生素菌渣,每年的產量更是高達200多萬t[15].抗生素菌渣因含有高含量的抗生素殘留,對環境污染產生巨大的潛在風險,不合理的處置方式極有可能引起抗生素或抗性基因污染[16-18].

堆肥法由于其能夠高效轉化有機污染廢物,已被用于越來越多的固體廢棄物處理.研究表明堆肥法能夠降解畜禽糞便、抗生素菌渣等固體廢棄物中的抗生素,使抗生素殘留降解到極低水平[19-22].并且,已有研究表明堆肥法處理畜禽糞便可以大幅消減ARGs的傳播和擴散[23-24].但是抗生素菌渣堆肥過程中ARGs的變化情況以及ARGs與環境因子的關系研究較少[25-26].本文采用分子生物學方法,運用熒光定量PCR技術,分析堆肥過程中ARGs的變化情況.同時,分析環境因子與ARGs的相互關系,以期為林可霉素菌渣堆肥化的環境安全性評價提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 堆肥材料

林可霉素菌渣取自河南省新鄉華星制藥廠;糠醛渣取自河南省新鄉縣糠醛廠;草木灰取自河南省新鄉縣秸稈電廠.污泥取自河南省新鄉劉莊生活污泥.供試材料的理化性質如表1所示.

表1 堆肥材料理化性狀

1.2 試驗處理

根據物料配比不同,設計2個處理.控制各堆體質量約900kg,初始含水率在60%左右.通過試驗測得草木灰的添加量為糠醛渣的20%時,糠醛渣的pH值即可調節到6.0左右.試驗處理如表2所示.

表2 堆肥實驗設計

堆肥過程中采取人工鐵鍬翻堆方式,3d翻堆一次.每3d取樣一次,測定水分,保持水分不低于50%,若低于50%后,加水保持水分55%~60%.

1.3 樣品采集

堆肥過程中每3d人工翻堆混勻一次,混合均勻后從堆體的前、后、左、右和中心5個點取樣,混勻為一個樣品.分兩部分分別保存于?20℃和4℃. ?20℃樣品進行抗生素殘留測定同時送上海生工股份有限公司進行抗性基因的測定;4℃樣品進行pH值、水分、有機質、全氮等的測定.初始樣、升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期樣品分別取自堆體的第0、13、34、55和66d,處理樣命名分別為:T0、T13、T34、T55、T66;對照樣分別命名為CK0、CK13、CK34、CK55、CK66.

1.4 抗生素殘留測定

取相當于堆肥干重10g的堆肥鮮樣,超純水50mL,渦輪振蕩5min.超聲萃取60min,過濾,以3000r/min的轉速離心30min,取上清液過0.45μm微孔濾膜后于HPLC上測定.色譜柱條件為:儀器型號為Agilent1200LC,儀器生產廠家為Supelco,色譜柱為Discovery C18柱,柱溫30℃,檢測器為紫外檢測器,檢測波長為214nm,流動相為0.05mol/L硼砂溶液(85%磷酸調節pH=6):甲醇=50:50;流速為1mL/min,樣品進樣量為20μL.

1.5 堆肥樣品DNA的提取

堆肥樣品 DNA 按照 FastDNA SPIN Kit for Soil 試劑盒說明書進行,用核酸蛋白質分析儀NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington. DE)測定DNA濃度,–20℃保存.

1.6 林可霉素抗性基因及細菌數量的熒光定量PCR

本文中所用的、1和16引物序列[27-28]及熒光定量PCR均由上海生工股份有限公司完成.所有引物先進行普通PCR擴增,凝膠電泳.檢測存在后再進行熒光定量PCR.15種抗性基因、1種整合子基因和16S rDNA引物序列經過標準PCR后,凝膠電泳發現只檢測到-01、1、、、和1、16S rDNA的條帶.所以這些基因進行后續熒光定量PCR.PCR具體參數見表3.

實驗中標準曲線的相關系數2值為0.9993~ 1.0000,擴增效率范圍為96.0%~108.2%.林可霉素抗性基因采用Taqman水解探針法制作qPCR標準曲線.反應為25mL體系,包括Taq Buffer 2.5mL,上下游引物各0.5mL,探針0.5mL,dNTP(10mmol/L)0.5μL, MgCl2(25mmol/L) 2μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL,超純水18.3μL.同時對細菌16S rRNA基因用SYBR染料法定量.

1.7 數據分析

所有數據采用Microsoft Excel 2010進行處理,采用Origin9.0進行作圖,用SPSS 進行相關性分析,用canoco 5.0進行冗余分析.抗性基因相對豐度=抗性基因拷貝數/基因拷貝數

表3 目的基因引物序列,退火溫度及序列長度

2 結果分析

2.1 林可霉素菌渣堆肥過程中溫度變化

圖1 堆肥過程中溫度變化

由圖1可以看出,林可霉素菌渣堆肥第5d即達到50℃以上高溫,最高溫度為第48d時的58℃,高溫保持時間高達51d.而污泥堆肥第3d即進入高溫期,最高溫度為第17d的62℃,高溫保持時間為45d.林可霉素菌渣堆肥最高溫度和高溫期均滯后于污泥堆肥.Ezzariai等[29]研究表明高濃度抗生素存在下,堆體高溫期和最高溫度出現時間嚴重滯后,與本文類似.

2.2 林可霉素菌渣堆肥中林可霉素殘留變化

圖2 堆肥過程中林可霉素殘留的變化

如圖2所示,林可霉素殘留降解趨勢先是緩慢降解,待堆肥進入高溫期后,降解速度加快.特別是堆肥前20d,降解率高達80%.表明堆肥化處理可以降低抗生素殘留,最終林可霉素殘留從最初的3180mg/kg降解到65mg/kg,降解率高達99%.堆肥化處理有助于大幅降解抗生素殘留,實現抗生素殘留的無害化.

2.3 抗性基因變化趨勢

為了消除DNA提取率和細菌數量的影響,用相對豐度來反映抗性細菌在整個細菌總量中的比例顯得更為準確.如圖3所示,5種抗性基因和整合子基因變化情況大致分為3類.

圖3 堆肥過程中抗性基因和整合子相對豐度的變化情況

2.3.1-01和基因的變化情況-01和隨著堆肥進程呈現急劇下降趨勢,堆肥34d后去除率均高達99%.分析原因可能是堆肥初始期2種抗性基因的宿主菌不耐高溫,待堆肥進入高溫期后,兩者抗性基因的宿主急劇減少所致.同時發現-01基因與林可霉素殘留呈現極顯著正相關,表明-01基因的宿主菌可能是林可霉素降解菌.

2.3.21作為整合子基因,能夠攜帶抗性基因進行物種間傳播,有基因漂流風險1和1這兩個基因在林可霉素菌渣堆肥和污泥堆肥過程中呈現相反趨勢.其中兩者在林可霉素菌渣堆肥中急劇增加,特別是在高溫期達到峰值,分別為初期的6.3和10倍.堆肥結束后兩者分別增加了5.1和7.3倍.而兩者在污泥整個堆肥過程中變化不大,堆肥結束后1增長12%,1增長24%.表明林可霉素菌渣堆肥有利于富集1轉座基因和1抗性基因,對環境生態存在一定風險.任省濤等[30]研究林可霉素菌渣與豬糞混合堆肥,結果表明林可霉素菌渣堆肥高溫期主要是不同屬類的芽孢桿菌,推測這些芽孢桿菌屬可能是1和1的主要宿主菌.

2.3.3和抗性基因兩者在林可霉素菌渣和污泥堆肥過程中均呈現相同趨勢,首先隨著堆肥進入高溫期兩者呈現急劇下降趨勢,高溫期一直維持較低含量,腐熟期后又有所上升.表明兩者的宿主細菌可能均不耐高溫.堆肥結束后在林可菌渣堆肥中減少51%,而在污泥堆肥中卻增加了59%.在兩者堆肥中分別減少40%和79%.堆肥結束后林可霉素菌渣堆肥中和相對豐度雖有一定程度的降低,但是總量依然高于污泥堆肥.

2.4 16S rDNA、AGRs、intI1和林可霉素相關性分析

表4 16S rDNA、AGRs、intI1和林可霉素相關性分析

注:*.在0.05水平(雙側)上顯著相關,**.0.1水平上的相關性.

通過SPSS進行相關性分析如表3所示,結果發現除了-01外,其余均與細菌16S呈顯著相關性.表明堆肥過程抗性基因的增多或減少主要是與細菌數量的多少顯著相關.同時發現1與1和呈現強相關性,表明1和抗性基因可能與整合子基因在同一質?；蛲蝗旧w上,Qian等[31]研究3種不同濃度的土霉素添加量對畜禽糞便堆肥中抗性基因的變化情況,結果發現,土霉素的添加有助于富集某些抗性基因與本文結論相同.

2.5 ARGs絕對和相對總量變化趨勢

2.5.1 ARGs絕對總量變化趨勢 由圖4可知,無論林可霉素菌渣堆肥還是污泥堆肥,兩者抗性基因總量隨著堆肥進程均有極大的增加,表明堆肥有助于抗性基因的富集.其中林可霉素菌渣堆肥初始時主要以-01、和為主,隨著堆肥進行,-01和急劇下降,1和1急劇上升.在高溫期34d總抗性基因量達到最大峰值,為初始樣本的750倍,堆肥進入腐熟期后有所降低,堆肥結束時抗性基因總量為初始樣的179倍,其中1、1和占據了總抗性基因的98%.而污泥堆肥開始時以1、1、和為主,堆肥結束時,兩種堆肥方式主要抗性基因趨同主要以1、1和為主,占據95%.抗性基因總量增長75倍.相關性分析(表3)表明,堆肥抗性基因與轉座子均與細菌數量呈顯著正相關,表明堆肥抗性基因的增加主要是由于堆肥細菌數量增加所致.1抗性基因在不同物種轉移方面具有潛在風險.二者堆肥結束后1較初始分別增加971倍和108倍,表明堆肥有助于1的富集,堆肥化處理方式存在生態風險.

2.5.2 ARGs相對總量變化趨勢 相對豐度可以較好的排除樣本DNA提取率和細菌數量的影響,代表了細菌群落中含有抗性基因細菌的比例.從一定意義上來說,作為環境生態評價更有意義.由圖5可以看出,林可霉素菌渣堆肥初始樣總抗性基因豐度遠遠大于污泥堆肥,可能是因為林可霉素殘留產生的選擇性壓力,導致抗性基因遠遠大于污泥堆肥.特別是高溫時林可霉素菌渣堆肥抗性基因豐度急劇升高,堆肥34d達到最大值, 為初始總抗性基因豐度的1.2倍.其中整合子基因1相對豐度在堆肥34d也達到了峰值,為初始樣的6倍,表明堆肥高溫期整合子基因l1發生了強烈的基因轉移作用.堆肥結束后,林可霉素菌渣堆肥中1增加了5倍,而污泥堆肥中1只增加了13%,表明林可霉素菌渣堆肥有助于富集1,存在生態風險.堆肥結束后二者抗性基因相對豐度較初始分別降低了5%~22%.從這一角度講堆肥化處理有利于抗性基因的消減.

圖4 堆肥過程中抗性基因絕對豐度的變化情況

圖5 堆肥過程中抗性基因相對豐度變化情況

2.6 ARGs與環境的相互關系

圖6可以看出, ARGs與環境因子做冗余分析, RDA兩軸可解釋度達到84.5%,表明環境因子對抗性基因具有很大影響.其中pH值、C/N、林可霉素殘留、溫度均對ARGs變化產生巨大影響.影響程度順序依次為pH值>林可霉素殘留>溫度>C/N.同時也發現堆肥不同階段環境因子影響因素也不同.堆肥初期到升溫期,林可霉素殘留對堆肥抗性基因-01影響顯著.隨著堆肥進入高溫期和腐熟期, pH值和溫度開始發揮作用.尤其對1、1、、、產生顯著影響.有研究表明高溫或pH值的急劇變化有可能導致某些細菌發生SOS應答,從而有利于富集某些ARGs以抵御不利環境[32-34].從圖6也可以看出兩者堆肥ARGs在堆肥初期和升溫期受林可霉素殘留的影響,兩者ARGs差異較大,隨著堆肥進行,差異逐漸減小.主要是因為林可霉素殘留的影響,隨著林可霉素殘留大幅降解,兩者堆肥ARGs逐漸趨同.抗生素可能只是在堆肥初期對堆肥微生物產生影響,從而導致ARGs的差異.

圖6 環境因子與抗性基因冗余分析

3 結論

3.1 堆肥化處理林可霉素菌渣可以大幅降解林可霉素殘留,降解率為99%.

3.2 堆肥ARGs總豐度的增加可能是由于堆肥細菌生物數量增加所致.

3.3 林可霉素菌渣堆肥中1絕對和相對含量均急劇增加,表明堆肥過程中發生了整合子基因水平轉移,林可霉素菌渣堆肥存在環境生態風險.

3.4 交互分析表明ARGs變化主要受環境因子影響,順序為pH值>林可霉素殘留>溫度>C/N.

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Variations of Antibiotic resistance genes during lincomycin mycelia dreg composting.

REN Sheng-tao1, GUO Xia-li1, LU A-qian1, ZHANG Qian-qian1, GUO Xiao-ying1, WANG Yan1*, WANG Lian-zhong2, ZHANG Bao-bao2

(1.College of Chemical Engineering and Energy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China；2.Henan Xinxiang Hua Xing Pharmaceutical Factory, Xinxiang 453731, China)., 2018,38(11)：4276~4283

In order to investigate the variation of antibiotic resistance genes during the antibiotic mycelia dregs composting process, five antibiotic resistance genes (-01,1,,,) and one horizontal gene transfer (1) were detected from the compost by quantitative PCR technique. The results showed that 99% lincomycin was degraded after composting. For both the lincomycin mycelia dreg compost and sewage sludge compost, the absolute total of ARGs was all increased. By contrast, the relative total of ARGs were all decreased by 5% and 22% respectively.1 was enriched in lincomycin mycelia dreg compost indicating the potential ecological risk. The redundancy analysis revealed that the antibiotic resistance genes were greatly influenced by the environmental factors and the order was pH>licomycin residue>temperature>C/N.

composting；antibiotic；lincomycin mycelia dreg；fluorescence quantitative PCR；antibiotic resistance genes

X172

A

1000-6923(2018)11-4276-08

任省濤(1983-),男,河南濮陽人,博士研究生,主要研究方向為生物化工.發表論文5篇.

2018-04-13

國家自然青年科學基金資助項目(41601524);河南新鄉華星藥廠研究課題(20160140A)

* 責任作者, 教授, wangyan371@zzu.edu.cn