鮮蛹蟲草與干蛹蟲草抗氧化活性和活性物質差異研究*

劉曉紅，宋 潔，欒宏偉，劉興寶，李 娟，朱雙杰，張 昕，賈成發，王淑君，王 鵬

（1.遼東學院農學院，遼寧 丹東 118003；2.丹東中科北和科技有限公司，遼寧 丹東 118003；3.滁州學院生物與食品工程學院，安徽 滁州 239012）

抗氧化劑在預防活性氧（reactive oxygen species，ROS） 引起的疾病中發揮著重要作用[1-2]。研究表明，ROS可引發機體退化或病理性事件，如癌癥、哮喘和衰老的發生[3-5]。ROS過量是由于體內自由基產生和抗氧化防御體系之間的不平衡造成的，抗氧化劑在改善免疫功能、減少氧化應激方面發揮重要作用。雖然生物體內存在多種內源抗氧化劑，主要有酶和非酶的形式，但仍然需要不斷地從飲食或補充劑中提取一定數量的外源抗氧化劑，以維持活性氧代謝的平衡，特別是在活性氧過度產生的情況下。研究表明，天然食材中獲得的抗氧化劑可以降低機體退化或病理性事件發生的風險。

蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.ex Fr.）Link]為子囊菌門 （Ascomycota） 肉座目 （Hypocreales） 麥角菌科 （Clavicipitaceae） 蟲草屬 （Cordyceps） 的模式種[6]。近年來，由于蛹蟲草具有多種藥用價值，受到研究者越來越多的關注[7]。在中國和東南亞市場蛹蟲草已作為藥物原料和保健食品銷售[8-9]。蛹蟲草的藥理功效包括免疫應答消炎、抗菌素、抗心律失常等[10-11]?，F代藥物化學研究表明，蛹蟲草含有腺苷、蟲草素、蟲草酸、蛋白質、多糖、超氧化物歧化酶等活性成分[12-15]，這些活性成分具有較強的抗氧化活性[16-19]。然而，以上研究均針對干蛹蟲草，關于新鮮蛹蟲草抗氧化性的研究甚少。

研究表明，熱處理可以改變新鮮藥材的化學組成、含量和活性物的結構[20-21]，導致鮮中藥材和干中藥材從化學成分到藥效都有很大的不同[22-23]。大量研究表明，鮮藥材具有許多獨特的臨床療效，在臨床疾病、急危重癥和創傷治療方面具有明顯優勢[24-25]。迄今，鮮見有關鮮蛹蟲草的研究，也未見關于鮮蛹蟲草和干蛹蟲草抗氧化活性差異的報道。因此，本研究擬對鮮蛹蟲草和干蛹蟲草的抗氧化活性進行評價，為蛹蟲草資源的精深加工提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

樣品：鮮蛹蟲草（No.JS-003） 由遼東生物產業研究所提供；干蛹蟲草：鮮蛹蟲草放置于50℃烘干箱內烘干48 h，然后稱重，7.5 g鮮品蛹蟲草可以獲得1.0 g干品蛹蟲草。

樣品處理：鮮蛹蟲草37.5 g磨碎加入37 mL蒸餾水，干蛹蟲草5.0 g加入50 mL蒸餾水混合，分別用高速勻漿器4 000 r·min-1勻漿10 min，勻漿液定容至100 mL，30℃超聲提取30 min，4層紗布過濾，濾液經冷凍干燥，獲得鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品，備用。

1.2 方法

1.2.1 DPPH自由基清除活力測定

利用Ozen.T等方法[26]，測定DPPH自由基清除活力。鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品分別與DPPH甲醇溶液混合，室溫、放置于暗室30 min，用分光光度計于517 nm處測定反應混合物的吸光度值。

1.2.2 銅離子還原能力的測定

采用Apak.R等方法[27]，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品分別與硫酸銅、新亞銅試劑和蒸餾水混合，室溫放置30 min，用分光光度計于450 nm處測定混合物的吸光度值。

1.2.3 羥基自由基清除活力測定

根據Sroka.Z和Cisowski.W方法[28]，略加修改，0.02 mol·L-1硫酸亞鐵 100 μL，0.15%雙氧水 45 μL，8 mmol·L-1水楊酸1 mL和蒸餾水4 mL按順序依次混合，將1 mL鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品分別添加到上述混合液中，37℃放置30 min，用分光光度計于593 nm處測定有色產物的吸光度值。

1.2.4 總酚提取與含量測定

總酚提?。豪肂renes.M和Savarese.M等的方法[29-30]，略加修改，鮮蛹蟲草樣品與甲醇/水（80∶20） 的溶液混合，室溫放置30 min，用Whatman過濾器將混合液過濾，除去不溶性顆粒，重復提取3次，收集合并濾液，40℃下真空蒸發，除去濾液中的甲醇，加入正已烷洗滌濾液3次，去除油脂類物質，再加入乙酸乙酯萃取出酚類物質，40℃下真空蒸發，干燥后的殘余物溶解在2 mL甲醇中，于4℃貯藏備用。

總酚測定：采用Folin-Ciocalteu法，略加改進，測定樣品的總酚含量。分別取鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品0.1 mL與2.5 mL蒸餾水混合，加入0.25 mL Folin-Ciocalteu試劑，再加入2%Na2CO3溶液2.5 mL，暗環境下，室溫放置120 min。用分光光度計于765 nm處測定反應混合物的吸光度值。

1.2.5 總黃酮提取和含量測定

總黃酮提?。豪肧un L.J.等的方法[31]，略加修改。鮮蛹蟲草樣品浸泡在70%乙醇溶液中2.5 h，其中液料比 （w·v-）1為1∶10，55℃超聲提取45 min，提取樣品經0.45 μm微孔濾膜過濾。收集濾液，重復提取2次。石油醚和乙酸乙酯脫脂，旋轉蒸發，真空濃縮干燥，獲得樣品粗提取物。

總黃酮含量測定：采用分光光度法測定黃酮類物質的含量。鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品各1 mL（4 mg·mL-1），分別加入100 μL濃度為1%的2-氨基乙基聯苯基硼酸酯溶液混合，室溫放置20 min。用分光光度計于404 nm處測定反應樣品的吸光度值。

1.2.6 多糖提取和含量測定

鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品各25 g，250 mL乙醚索氏提取脫脂，加入250 mL80%乙醇混合24 h。過濾，收集濾液，用500 mL蒸餾水超聲重提殘留物2 h。然后合并濾液，蒸發濃縮至體積為100 mL，濃縮后的濾液與100 mL氯仿/異戊醇（4∶1） 混合進行脫蛋白處理。再過濾，濾液與4倍體積無水乙醇混合24 h，沉淀出的物質即為多糖化合物。離心收集沉淀，丙酮洗滌。最終鮮蛹蟲草樣品得到多糖1.44 g，干蛹蟲草樣品得到多糖1.06 g。

1.2.7 蟲草素和腺苷含量的測定

采用高效液相色譜法[32]，測定鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品中蟲草素和腺苷含量。C18柱（Pinnaclell 5 μm，250 mm×4.6 mm），流動相中磷酸氫二鈉緩沖液（pH6.0）：甲醇為 85∶15，流速 1 mL·min-1，檢測波長260 nm，加樣量20 μL，用Waters Empower軟件進行數據分析。

1.2.8 超氧化物歧化酶純化和活性測定

超氧化物歧化酶純化：參照Wang Z.S.等的方法[33]，分別取50 g鮮蛹蟲草和干蛹蟲草凍干粉，加入 250 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液 （pH8.8）中，其中含有1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟，均質離心（15 000 r·min-1）15 min。均質粗提液加硫酸銨飽和溶液中攪拌1.5 h，15 000 r·min-1離心15 min。取上清液，加到90%硫酸銨溶液中攪拌、離心，上清液溶入20 mmol·L-1Tris-HCL緩沖液 （pH8.8） 中，再用 20 mmol·L-1Tris-HCL緩沖液 （pH8.8） 透析 2次，過夜。透析所得蛋白在DEAE-FF陰離子交換層析柱（3 cm×12 cm） 上進行純化，平衡液為 20 mmol·L-1Tris-HCL緩沖液（pH8.8），采用冷凍干燥法濃縮具有高超氧化物歧化酶活性的層析液。

超氧化物歧化酶活性測定：采用對鄰苯三酚氧化法測定超氧化物歧化酶活性[34]。以牛血清白蛋白為標準蛋白，采用Braford法測定蛋白質[35]。

1.2.9 總抗氧化活性測定

采用Trolox等效抗氧化活性（trolox equivalent and oxidant capacity，TEAC） 方法[36]，測定樣品總抗氧化活性，2,2’-聯氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）（100 μmol·L-1），雙氧水（50 μmol·L-1）和過氧化物酶（4.4 U·mL-1）混合產生ABTS·+，1 mL ABTS·+分別加入到鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品和奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox） 標準品中，室溫放置10 min，分光光度計于734 nm處測定吸光度值，根據標準曲線，估算TEAC值。

2 結果分析

2.1 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對DPPH自由基清除能力

以生育酚作為對照，研究鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對DPPH自由基清除能力的影響，結果見圖1。

圖1 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris on DPPH radical

由圖1可知，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品濃度在0～4.0 mg·mL-1時，隨著濃度的升高，對DPPH自由基清除能力不斷增強，當樣品濃度為4.0 mg·mL-1時，鮮蛹蟲草樣品DPPH自由基的清除能力增強到86.63%，干蛹蟲草樣品達到61.36%。顯然鮮蛹蟲草樣品對DPPH自由基清除能力明顯強于干蛹蟲草樣品。樣品濃度在 4.0 mg·mL-1～8.0 mg·mL-1時，鮮蛹蟲草樣品清除能力超過85%，高于相同濃度下生育酚對照樣品的清除能力。

2.2 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對銅離子還原的抑制作用

以生育酚作為對照，研究鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對銅離子還原的抑制作用，結果見圖2。

圖2 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對銅離子還原的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of fresh Cordyceps militaris and dryCordyceps militaris on copper ion reduction

由圖2可以看出，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品濃度在0～4.0 mg·mL-1時，對銅離子還原的抑制作用具有濃度依賴性。在 1.0 mg·mL-1～8.0 mg·mL-1濃度范圍內，鮮蛹蟲草對銅離子還原的抑制作用明顯強于干蛹蟲草。濃度在 0.01 mg·mL-1～1.0 mg·mL-1時，鮮蛹蟲草樣品對銅離子還原的抑制作用弱于對照生育酚。鮮蛹蟲草濃度處于 2.0 mg·mL-1～8.0 mg·mL-1高濃度時，對銅離子還原的抑制作用強于對照生育酚。

2.3 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對羥基自由基的清除能力

以生育酚作為對照，研究鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對羥基自由基的清除能力，結果見圖3。

圖3 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草對羥基自由基的清除能力Fig.3 Scavenging activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris on hydroxyl radical.

由圖3可知，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品對羥基自由基均具有較強的清除能力，樣品濃度在0～8.0 mg·mL-1范圍內，兩者對羥基自由基清除能力具有濃度依賴性，但鮮蛹蟲草樣品對羥基自由基清除能力顯著高于干蛹蟲草樣品（P＜0.05）。當樣品濃度為2 mg·mL-1時，只有鮮蛹蟲草清除能力高于對照生育酚，在 4.0 mg·mL-1～8.0 mg·mL-1時，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品清除能力均明顯強于對照生育酚。綜上所述，鮮蛹蟲草清除能力強于干蛹蟲草。

2.4 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草主要活性成分含量和抗氧化活性比較

鮮蛹蟲草和干蛹蟲草主要活性成分含量見表1。

由表1可知，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品在多糖、總酚、總黃酮含量方面均存在顯著性差異（P＜0.01），這三種活性成分在鮮蛹蟲草樣品中的含量均高于干蛹蟲草樣品，并且鮮蛹蟲草和干蛹蟲草樣品中活性成分含量排序為，總黃酮含量＞總酚含量＞多糖含量，腺苷和蟲草素含量無明顯差異。

表1 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草主要活性成分含量及其抗氧化活性比較Tab.1 Compare of the main active components content and antioxidant activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris

由表1還可以看出，干蛹蟲草樣品抗氧化活性顯著低于鮮蛹蟲草樣品（P＜0.01）。超氧化物歧化酶純化過程有3個階段，獲得的3種提取液分別為粗提液、硫酸銨沉淀物和陰離子交換層析液，檢測3種提取液中總蛋白含量和超氧化物歧化酶的活性結果，見表2。

表2 鮮蛹蟲草和干蛹蟲草中超氧化物歧化酶含量及活性比較Tab.2 Compare of the superoxide dismutase content and activity of fresh Cordyceps militaris and dry Cordyceps militaris

由表2可以看出，鮮蛹蟲草中超氧化物歧化酶的含量與總活力均高于干蛹蟲草，且超氧化物歧化酶純化提取物中，鮮蛹蟲草所得粗提液和硫酸銨沉淀物比活度是干蛹蟲草的1.3倍（P＜0.01），鮮蛹蟲草中陰離子交換層析液比活度是干蛹蟲草的1.8倍。

2.5 鮮蛹蟲草中主要活性成分抗氧化活性

鮮蛹蟲草中超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃酮的抗氧化活性，見圖4。

圖4 鮮蛹蟲草中超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃酮的抗氧化活性Fig.4 Total antioxidant activity of the superoxide dismutase,polysaccharide,polyphenol and total flavonoids of fresh Cordyceps militaris

由圖4可知，樣品濃度在0～8.0 mg·mL-1之間，蛹蟲草的超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃酮的抗氧化活性隨著濃度的升高而增大，這說明鮮蛹蟲草中的超氧化物歧化酶、多糖、總酚和總黃銅具有較強的抗氧化活性。鮮蛹蟲草中腺苷和蟲草素總抗氧化性活性見表3。

由表3可以看出，根據不同濃度組合，分別測定鮮蛹蟲草中多糖和腺苷組合、多糖和蟲草素組合后的TEAC值，所得結果與鮮蛹蟲草多糖抗氧化活性TEAC值相比無顯著差異。鮮蛹蟲草樣品中多糖和腺苷組合、多糖和蟲草素組合的清除能力與鮮蛹蟲草樣品多糖幾乎一樣，表明腺苷和蟲草素這兩種生物活性成分不能促進蛹蟲草的抗氧化活性。

表3 鮮蛹蟲草中腺苷和蟲草素總抗氧化性活性Tab.3 Total antioxidant activity of adenosine,cordycepin of fresh Cordyceps militaris

3 討論

生物系統中抗氧化系統很復雜[37]，采用不同方法分析抗氧化活性可得不同的反應特性和機理，在實際研究中，至少使用2種互補的方法來評價體外抗氧化能力[38]。DPPH自由基是穩定的自由基，DPPH自由基清除能力檢測法是1種評價抗氧化活性的快速方法[39]。銅離子對機體內的硫醇類抗氧化劑如谷胱甘肽具有反應性[40]，由于體內廣泛存在羥基自由基[38，41]，故羥基自由基清除能力的檢測被廣泛用于抗氧化活性的測定。此外，在測定特定物質的抗氧化能力時，Trolox等效抗氧化活性檢測也被常用于評價活性物質的抗氧化能力。因此我們選擇了這四種方法來評價鮮蛹蟲草和干蛹蟲草的抗氧化能力。結果表明，4種方法均能較準確地反映鮮蛹蟲草和干蛹蟲草抗氧化活性。

目前，在中國、韓國和東南亞地區，蛹蟲草被作為醫藥材料和保健食品出售[9]。研究表明，蛹蟲草具有顯著的治療效果，如免疫刺激[17]。已有研究表明，蛹蟲草提取物能提高小鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶的酶活性，降低H22型小鼠肝臟中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的含量。近年來，大量試驗數據表明，蛹蟲草子實體水提取物對寄主具有抗氧化活性[42]。蛹蟲草子實體水提液顯示了對DPPH、羥基自由基明顯的清除能力和對亞鐵離子的螯合作用，對亞油酸脂質過氧化和還原能力也有抑制作用[16]。本研究顯示，干蛹蟲草具有較強的DPPH自由基清除能力、銅離子還原能力和羥基自由基清除能力，且均呈劑量依賴性，但其抗氧化活性顯著低于鮮蛹蟲草，且鮮蛹蟲草濃度在 4.0 mg·mL-1～8.0 mg·mL-1時，抗氧化活性明顯高于生育酚。所以鮮蛹蟲草是1種天然的抗氧化劑資源。

抗氧化能力與活性成分的含量有關。蛹蟲草的主要成分為超氧化物歧化酶、蟲草素、腺苷和蟲草多糖[13]。這些主要成分中，除了蛹蟲草多糖外，其他活性成分的抗氧化活性僅有少量報道[18]。另外，已有報道表明總酚和總黃酮具有良好的抗氧化能力。為進一步探討活性成分在鮮蛹蟲草和干蛹蟲草抗氧化活性中的作用，本研究測定了鮮蛹蟲草和干蛹蟲草中主要活性成分，包括超氧化物歧化酶、多糖、腺苷、蟲草素、總酚和總黃酮含量。本研究顯示，除活性成分腺苷和蟲草素外，鮮蛹蟲草中其他活性成分均明顯高于干蛹蟲草，導致這種結果可能有2個因素，一是熱處理使部分活性成分裂解，另一個是由于酶的作用使熱敏成分分解[20]。

此外，為闡明蛹蟲草主要活性成分對抗氧化活性的影響，本試驗從蛹蟲草中分別提取出多糖、超氧化物歧化酶、總酚和總黃酮，并采用了Trolox等效抗氧化活性檢測法評價了其抗氧化活性。Trolox等效抗氧化活性綜合分析方法優于多個測定分析的方法，能有效評價樣品的抗氧化能力。由于蟲草多糖已被證明具有顯著的抗氧化活性，本研究以蛹蟲草多糖為對照。數據統計分析顯示，腺苷和蟲草素不能促進蛹蟲草抗氧化活性。此結果與Yu和Yang[17]結論相一致。關于鮮蛹蟲草和干蛹蟲草超氧化物歧化酶抗氧化活性鮮有報道，本研究結果顯示，鮮蛹蟲草超氧化物歧化酶抗氧化活性顯著高于干蛹蟲草。此外，鮮蛹蟲草提取物中總酚和總黃酮含量分別為（87.56±0.04） mg·g-1和 （182.24±0.07） mg·g-1，干蛹蟲草為 （58.34±0.03） mg·g-1和（125.86±0.03）mg·g-1，均表現出明顯的抗氧化活性，這與已報道結論不一致，先前有研究顯示蛹蟲草中總酚和總黃酮的含量分別為 0.598 μg·mL-1和 60.2 μg·mL-1，這種相對含量較低的活性物質對蛹蟲草的抗氧化活性貢獻率是很低的[17]。

綜上所述，本研究表明，鮮蛹蟲草和干蛹蟲草均具有抗氧化活性，而且鮮蛹蟲草的抗氧化活性優于干蛹蟲草。此外，鮮蛹蟲草中多糖、超氧化物歧化酶、總酚和總黃酮等活性成分的含量均高于其在干蛹蟲草中的含量。鮮蛹蟲草所含的多糖、超氧化物歧化酶、總酚和總黃酮等成分具有顯著的抗氧化活性。這些結果表明，鮮蛹蟲草是良好的抗氧化劑資源，有待進一步開發利用。