細胞周期蛋白家族基因在家蠶5齡幼蟲精巢發育過程中的表達分析

劉麗華，付熙瑤，王嘉陽，劉美琦，單子笑，欒雪紅

細胞周期是細胞生命活動的基本過程，細胞在周期時相的變遷中進入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態［1］.調控細胞周期的蛋白主要包括細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴激酶（Cyclindependent kinase，CDK）及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（Cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）.其中，Cyclin為正調控蛋白家族，通過依次激活相應的CDK活性，從而推動細胞周期進程［2］.Cyclin廣泛存在于多種生物體內［3-4］，在哺乳動物細胞中發現了20多種，在家蠶體內報道了6種，即CyclinA［5］、CyclinB［6］、CyclinB3［6］、CyclinE［7］、CyclinL1［8］、CyclinH［9］.

家蠶是重要的經濟昆蟲，生殖及發生與家蠶的經濟性狀密切相關，研究家蠶生殖與分化對蠶種、蠶絲生產具有重要的理論指導意義［10］.家蠶精巢發育是一個極其復雜的生理過程，受到多種因素的調節，包括激素、營養、基因調節等等，同時在此過程中伴隨著精子的發生過程，這一過程經歷有絲分裂及減數分裂等，最終發育為成熟的精子，在此過程中細胞周期蛋白發揮重要的調控作用.為了從分子水平上探索家蠶精巢與精子發生機制，本文通過檢測家蠶精巢在5齡幼蟲不同發育時期細胞周期蛋白基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在轉錄水平上的表達變化，旨在為揭示細胞周期蛋白在家蠶生殖細胞發生過程中的分子機制提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用的家蠶品種是由蘇州大學基礎醫學與生命科學學院蠶桑實驗室提供的大造，用桑葉在26℃、濕度65%～75%條件下飼養.分別取家蠶5齡1～8d幼蟲精巢凍存于液氮中備用.

1.2 方法

（1）精巢組織總RNA提取及cDNA制備.家蠶5齡1～8d幼蟲精巢總RNA提取，按照Trizol-A+試劑盒（TaKaRa公司）說明書進行，測定OD值，檢測其濃度和純度.反轉錄采用TaKaRa公司的M-MLV反轉錄試劑盒進行.

（2）實時熒光定量 PCR.CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因、Actin3內參基因的引物設計及實時熒光定量PCR過程均與本文作者劉麗華［11］等相同.

（3）構建標準曲線.用雙蒸水以10倍梯度分別將上述基因稀釋成6個濃度梯度，進行Realtime PCR，以所得Ct值（循環閾值）為縱坐標，log值（對應的模板拷貝數常用對數）為橫坐標制作標準曲線.

（4）數據分析.利用ABI 7300儀器自帶的Sequence detection software version 1.3.1軟件對檢測結果進行分析，并參照 Jan H Schefe［12］的方法進行效率校正.

2 結果

2.1 實時熒光定量反應標準曲線繪制

家蠶細胞周期蛋白家族基因的實時熒光定量PCR標準曲線如圖1所示.由圖1可知，擴增曲線良好，各曲線相關系數R2均大于0.99，符合定量PCR的要求.

2.2 細胞周期蛋白家族基因在家蠶5齡幼蟲精巢不同發育時期的表達

對家蠶5齡幼蟲不同發育時期精巢的Cyclin家族基因mRNA轉錄情況進行檢測.結果如圖2所示，細胞周期蛋白家族基因在5齡幼蟲期都能檢測到表達.CyclinB相對轉錄表達水平遠遠高于其他成員，而CyclinA相對表達水平較低，并且呈現出逐漸降低的趨勢.其他細胞周期蛋白家族基因在5齡2d時，轉錄表達水平均呈下降趨勢，而后逐步上升5d后，則相對表達水平又降低.

圖1 家蠶細胞周期蛋白家族基因的實時熒光定量PCR標準曲線

圖2 家蠶Cyclin家族基因在5齡幼蟲1～8d精巢中的轉錄特征

3 討論

在發育生物學中，個體形態建成以及性腺形成是兩個非常重要的過程.很多基因在這些過程中起著重要作用，他們相互作用調控著整個發育過程，其中細胞周期蛋白基因起著非常重要的作用.已有研究表明，細胞周期蛋白家族基因在5齡中期各組織的轉錄水平存在差異，除CyclinE在脂肪體中表達較高外，其他成員都在精巢中表達量最高［12］，說明Cyclin家族基因在家蠶精母細胞形成精子的過程中發揮著重要作用.

本試驗在轉錄水平上對家蠶5齡幼蟲Cyclin家族基因在精巢不同發育階段的表達進行了檢測.結果表明，Cyclin家族基因在5齡幼蟲精巢不同發育階段都能檢測到表達，但表達水平相差很大.CyclinA相對表達水平較低，并呈現出逐漸降低的趨勢，這與家蠶在此期的生長發育特點相關，家蠶生長到3齡末4齡初時，進入成熟期，開始進行減數分裂，第一次減數分裂周期很長，一直持續到4齡末或5齡初才進入中期、后期而完成分裂.有研究證明，CyclinA1只在哺乳動物雄性生殖細胞的第一次減數分裂之前或期間表達［13］，CyclinA1的關鍵作用是在生精細胞的減數分裂期激活CyclinB，從而使細胞完成G2/M期的轉換過程［14］.這與本試驗的研究結果相同.CyclinB的轉錄表達水平遠遠超過其他成員，已有研究表明，哺乳動物B型周期蛋白在睪丸生殖細胞中表達水平很高［15］，說明CyclinB基因與精母細胞的減數分裂、精細胞的大量形成有密切關系.CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在5齡2d時，轉錄水平均呈下降趨勢，而后逐步上升5d后則相對表達水平下降.表明此期精母細胞成熟分裂即將完成，進入變形期.

精子發生是一個特殊的雄性生殖細胞的分化過程，也是一個特殊的細胞周期運行過程，在此過程中，特定的基因嚴格按照時間、空間順序表達.細胞周期蛋白與有絲分裂、減數分裂密切相關，Debra J等研究證實細胞周期蛋白基因在精子發生過程中參與了關鍵性調控［16］.因此，對細胞周期調控基因的表達研究將為深入了解生精過程的分子機制奠定基礎.