玉米大斑病抗病鑒定谷物粒培養基產孢因素探討

蒙 成，黃艷花，梁慶平，蔣益敏，吳 地

(廣西農業職業技術學院，廣西南寧 530007)

【研究意義】玉米大斑病(Northern leaf blight of corn)是玉米的一種重要葉部病害，在我國各地普遍發生，對玉米產量影響嚴重，一般可導致減產20%左右，嚴重時減產可達50%［1－4］。該病害由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起，病菌可通過分生孢子實現病害遠距離傳播［5］。利用抗病種質資源，選育和種植抗病品種是控制玉米大斑病流行的有效措施［6］。在抗病品種選育過程中，必須進行抗病性鑒定接種。孢子懸浮液噴霧接種和粉碎玉米病葉接種，受降雨和環境相對濕度影響較小，是開展玉米大斑病抗病性鑒定較好的人工接種方法。大田進行抗病性鑒定接種需要大量接種體，因此，探索影響分生孢子產生的外界條件，從而獲得大量分生孢子對玉米大斑病抗病性接種鑒定具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】在抗病品種的選育與利用過程中，抗病性鑒定已成為玉米育種及其區域適應性的常規工作。玉米大斑病抗病性鑒定常用方法有:把保存的玉米大斑病菌接種在PDA斜面上，待產生大量孢子后用無菌水配成孢子懸浮液噴霧接種［7］;采用高粱粒培養基培養玉米大斑病分生孢子做接種體，然后放入玉米心葉內接種［8－11］;也有把玉米大斑病病葉粉碎撒在玉米心葉內接種［12－13］;劉燁玨等［14］研究結果表明，菌液灌心和帶菌高粱粒接種可以保證玉米單株接種量一致，同時，接種體被接種于玉米心葉中，保證了玉米大斑病菌孢子萌發所需的水分和濕度，提高病菌侵染率;分生孢子在不同營養及培養環境條件下，其產孢效果差異顯著。沈江衛等［15］研究結果表明:甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata Elliset Halsted)在番茄培養基上生長最好，在胡蘿卜培養基上生長最差;分生孢子產量以在PDA培養基上最多，在玉米粉培養基上最少;菌絲適宜生長溫度25℃，在15℃下分生孢子產孢量最大;光照條件對黑斑病菌分生孢子產孢量沒有明顯差別。劉海英等［16］認為繼代培養一般會引起微生物退化，但也不排除使微生物增強適應性的可能。利用谷物粒(麥粒，玉米粒，高梁粒等)培養基制備接種體是目前病害接種中廣泛使用的方法之一。玉米大斑病分生孢子通常采用高粱粒培養基來培養［17］，但產孢效果不甚理想，且在實際操作中，制備的接種體往往存在污染率高、滋長小昆蟲、制備慢和操作過程復雜等缺點。馮勝澤等［18］和姜開梅等［19］利用其他平板培養基來做產孢實驗，但這些產孢方法操作過程繁瑣，不便于大面積抗病鑒定操作，不能用帶病菌組織進行接種。目前，關于玉米大斑病利用谷物粒培養基培養分生孢子，并對其產孢影響因素進行研究尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】為獲得產孢效果好、成本低且操作簡單、便于進行大面積抗病性鑒定。以高粱粒、小麥粒、玉米粒為主要材料，以玉米葉、甘露醇、碳酸鉀、硫酸鎂、磷酸鈉等為輔料，組配25種植物組織培養基開展產孢量試驗，同時對溫度、培養時間、光照、同一菌株不同代數等影響產孢因素進行探討?！緮M解決的關鍵問題】對影響玉米大斑病抗病鑒定谷物粒培養基產孢因素進行探討，尋找一種谷物粒培養基及其培養方法，在玉米大斑病抗病鑒定時獲得產孢效果好、成本低且操作簡單、便于進行大面積抗病性鑒定，可以用帶病菌谷物粒進行接種，為玉米大斑病抗病鑒定工作的簡化性、時效性、準確性提供保障。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

在玉米大斑病集中發生期，從田間采集具有典型玉米大斑病癥狀的葉片進行病菌分離:在PDA培養基上進行單病斑分離(第1代)，經純化后(第2代)進行單孢子分離(第3代)，獲得野生型玉米大斑病菌菌株，即為供試菌株。

1.2 供試培養基

供試培養基，分別由高粱粒、小麥粒及玉米粒為主要材料，以甘露醇、碳酸鉀、硫酸鎂、磷酸鈉、玉米葉等為輔料，單因素組配25種培養基。高粱粒處理方法:挑選籽粒飽滿、大小一致、無病蟲的帶皮高粱水煮25 min后水洗瀝干備用;小麥粒處理方法:挑選籽粒飽滿、大小一致、無病蟲的帶皮小麥粒浸泡20～25 min后，水煮15～18 min后水洗瀝干備用;玉米粒的處理方法為:挑選大小一致、無病蟲的玉米粒侵泡12～15 h，水煮1h，水洗瀝干備用;玉米葉用從大田采集新鮮嫩葉切成約1 cm2的碎片備用;培養基制作方法:按配方配置，把所需成分混勻，濕度以藥品能溶解，玉米葉能摻和在籽粒上而無滴水為度。配好的培養基裝入250 mL的三角瓶中(簡稱培養瓶，下同)，每瓶裝100 g，經121 Pa高壓滅菌45 min備用。

1.3 供試儀器

供試培養箱為珠江牌培養箱，型號:LRH-250-GSB1。

1.4 不同培養條件對分生孢子產量的影響

1.4.1 培養基對分生孢子產量的影響 單因素組配25種植物組織培養基進行產孢量試驗，每個配方一個處理，共25個處理(表1)，3次重復。供試菌株在PDA培養基上擴繁6 d，菌絲長滿9 cm培養皿后，用帶PDA培養基的菌絲接種到供試谷物粒培養基上，每份處理接種半皿菌塊(下同)，接種后的培養瓶置于20℃、12 h黑暗12 h光照(光照強度2000 lx)的培養箱中培養11 d，測定產孢量。

1.4.2 溫度對分生孢子產量的影響 以9號培養基為供試培養基，分別在 8、12、16、20、24、28、32 和36 ℃共8 個溫度梯度［20］、光周期:12 L∶12 D(光照強度2000 lx)條件下培養，3次重復，培養11 d后測定產孢量。

1.4.3 光照條件對分生孢子產量的影響 以9號培養基為供試培養基，分別在24 D、12 L∶12 D(1500、2000、3000 lx等3種不同光照強度梯度)、24 L(光照強度3000 lx)共5種不同光照處理下20℃恒溫培養 11 d［18］，3 次重復。

1.4.4 培養時間對分生孢子產量的影響 以9號培養基為供試培養基，接種后的培養瓶分別置于20℃和24℃、12 L∶12 D光照(光照強度2000 lx)條件培養箱中培養，3 次重復。于第 5、7、9、11、15、20 和25 d測定產孢量。

1.5 供試菌株不同代數對分生孢子產量的影響

將供試菌株(第3代)的菌塊移植在PDA平面培養基上(即為第4代)，置于25～26℃溫箱中培養，同時移植在PDA斜面培養基上作為分代保存菌種。每一代培養7 d時用菌塊繼代轉移1次，連續對菌株進行菌塊繼代移植和培養，可獲得該病菌的繼代培養菌種，共移植到第10代，斜面培養基保存的分代菌種培養7 d后放入4℃進行保存［21］。試驗時將3～10代的菌種做試驗處理，以9號培養基為供試培養基，8個處理，3次重復。接種后的培養瓶放入20℃、12 h黑暗12 h光照(光照強度2000 lx)條件下培養11 d后測定產孢量。

1.6 分生孢子產量的測定

取各處理菌粒2 g放入50 mL燒杯加水10 mL，用不繡鋼勺子連續攪拌約100次，以保證能將菌株所產生的分生孢子刮下至孢子脫落水里，過濾得到的孢子懸浮液，用血球記數板計算1 mL孢子懸液中所含的孢子數，折算每g培養基產生的孢子量。每處理取樣3次，每樣品讀數3次。

表1 25種供試培養基Table 1 25 tested media

圖1 不同培養基對產孢量的影響Fig.1 The effect of different media on conidia production

2 結果與分析

2.1 不培養基對產孢量的影響

將供試菌株分別接種在25種不同培養基上，培養11 d后觀察發現每種培養基上均有分生孢子產生，但其產孢量不同。由圖1可知，18個不同配方的培養基產胞量顯著高于對照，配方小麥100 g+甘露醇2.5 g+玉米葉15 g的9號培養基產孢數量最多，為1.69 ×105個/g;配方玉米100 g+甘露醇2.5 g+碳酸鉀0.2 g+玉米葉15 g的20號培養基產孢量次之，為1.49 ×105個/g;排第 3、4、5、6、7 的分別為5、3、11、12、19 號培養基，產孢量分別為 1.28 ×105、1.18 × 105、1.13 × 105、1.13 × 105、1.09 × 105個/g;14號與22號培養基產孢量相當，分別為7.20×104、6.18 ×104個/g;17、6、8 號培養基產孢量相同，其與13、21、2、15號培養基產孢量相當，產孢量依次為 2.17 × 104、3.63 × 104、3.44 × 104、2.61 ×104、2.29×104個/g;1號和24培養基產孢量相同，產孢量為1.02×104個/g;25號常用高粱培養基(CK)產孢量為9.10 ×103個/g;10、7、18、16、23、4 號培養基產孢量較對照少，分別為8.92×103、8.92×103、5.10 × 103、3.18 × 103、2.55 × 103、2.00 × 103個/g。因此，9號培養基為玉米大斑病菌分生孢子產生的最佳培養基。

圖2 不同溫度對產孢量的影響Fig.2 The effects of different temperatures on conidia production

2.2 不同溫度條件對產孢量的影響

由圖2可知，培養溫度對玉米大斑病菌分生孢子產生的影響較大，溫度過低或過高都不利于分生孢子產生。20℃條件下產孢量顯著高于其它，24℃條件下產孢量其次，溫度≤8℃或≥32℃時，不產生分生孢子。因此，接種后的培養基在20℃條件下培養是玉米大斑病菌分生孢子產生的最適宜溫度。

2.3 不同光照條件對產孢量的影響

圖3 光照對產孢量的影響Fig.3 Effects of light treatments on conidia production

圖4 不同培養時間對產孢量的影響Fig.4 The effects of different culture duration on spore production

由圖3可知，光照條件對玉米大斑病菌產孢量有一定影響，適量光照對該病菌產孢有促進作用。12 L∶12 D，2000 lx光照強度條件下產孢量顯著高于其它光照條件，產孢量為1.69 ×105個/g;12 L∶12 D，光照強度1500 lx條件下產孢量次之，產孢量為1.41×105個/g;高強度光照即12 L∶12 D，光照強度3000 lx條件對該病菌產孢量有明顯抑制作用，產孢量為2.7×104個/g;24D條件下不利于產孢，產孢量為8.99×104個/g;24 L，光照強度為3000 lx條件下最不利于產孢，產孢量僅為1.71×104個/g。

2.4 不同培養時間對產孢量的影響

由圖4可知，培養時間對玉米大斑病菌產孢量影響差異顯著。20和24℃條件下培養時間7～11 d，培養時間越長，產孢量顯著增加，20℃條件下培養11 d產孢量最多;培養時間11～25 d，培養時間越長，產孢量顯著減少。因此，在20℃條件下，培養時間在第11天是玉米大斑病菌分生孢子產生量最多的時間。

2.5 供試菌株不同代數對產孢量的影響

由圖5可知，玉米大斑病菌經菌塊繼代轉移和培養，不同代數對產孢量影響差異顯著。產孢量隨著代數增加而遞減。第3代產孢量最高，為1.69×105個/g;第 4 代其次，產孢量為 1.36 ×105個/g;因此，第3代菌株最有利于玉米大斑病菌分生孢子生長，產孢量最多。

3 討論

圖5 菌株不同代數對產孢量的影響Fig.5 Effects of different strain generations on the conidia yield

在促進植物病原真菌產孢的研究進程中，方中達［22］認為培養基與孢子產生的關系最大，采用不同培養基或者改變它們的成分，是促進孢子產生的最主要途徑;劉麗麗等［23］認為不同培養基對多數茄鏈格孢的產孢量有明顯影響;莊義慶等［24］認為綠豆湯培養液是蕉斑鐮刀菌液體搖瓶產孢最好的培養液，在適宜條件下，產孢量達到1×106mL－1;蘭成忠等［25］認為辣椒疫霉菌在胡蘿卜、黑麥和燕麥培養基均能產生孢子囊，胡蘿卜培養基上產生孢子囊的數量最多;馮勝澤等［18］用13種不同培養基誘導玉米大斑病菌分生孢子的產生，發現使用玉米籽粒葡萄糖瓊脂培養基(CDA)、玉米籽粒瓊脂培養基(CA)及水瓊脂培養基(WA)3種培養基產孢量較低，均≤8.89×103個/mL，PDA 培養基產孢量為 1.32 ×105個/mL，而玉米葉片葡萄糖瓊脂培養基(CLDA)最有利于分生孢子的產生，產孢量達到 1.63×105個/mL，使用含有玉米葉片的CLDA培養基與使用普通PDA培養基相比產孢量差異顯著。本研究采用25種不同谷物粒培養基誘導玉米大斑病菌分生孢子產生，發現使用配方為小麥100 g、甘露醇2.5 g、玉米葉15 g的9號培養基最佳，產孢量最多，產孢量為1.69 ×105個/g;配方為玉米 100 g、甘露醇 2.5 g、碳酸鉀0.2 g玉米葉15 g的20號培養基其次，產孢量第二，產孢量為1.49×105個/g，說明，這兩種培養基搭配合理，適宜玉米大斑病菌生長。

陳利峰和徐敬友［26］研究結果表明，玉米大斑病菌分生孢子形成溫度為13～30℃，產孢最適溫度為20℃;馮勝澤等［18］認為培養溫度過低或過高都不利于分生孢子的產生，在15、35℃均不產生分生孢子，僅在20、25、30 ℃能夠產生孢子，其中在 20、30℃的產孢量較少，25℃為病菌分生孢子產生的最適宜溫度。本研究認為:玉米大斑病菌在溫度≤8℃或≥32℃時，不產生分生孢子;16～24℃產孢量較多，其中20℃條件下產孢量最多。說明，培養溫度過低或過高都不利于玉米大斑病菌生長，低于8℃或32℃以上病菌停止生長。

光照條件對玉米大斑病菌生長影響差異顯著，本研究發現，在全光照培養條件下(光照強度3000 lx)顯著抑制分生孢子產生;12 h黑暗12 h光照培養條件與全黑暗培養相比，光照強度3000 lx抑制分生孢子產生，光照強度2000 lx促進分生孢子產生;連續24 h黑暗條件下不利于分生孢子產生。說明在玉米大斑病菌中不同光照強度對分生孢子產生的影響不同。由此可見，在不同植物病原真菌中，光照時間、光照強度、光質等對病菌分生孢子產生均具有不同程度影響，本研究結果與馮勝澤等［18］研究結果基本一致。

培養時間對玉米大斑病菌產孢量差異顯著。以配方小麥100 g、甘露醇2.5 g、玉米葉15 g的培養基在20和24℃條件下，培養7～11 d、培養時間越長，產孢量顯著增加;培養11～25 d培養時間越長，產孢量顯著減少。因此，該配方的培養基在20和24℃條件下，培養時間11 d是玉米大斑病菌分生孢子產生量最多的時間。其它配方的培養基，其產孢量與培養時間關系是否與該配方培養基相一致，有待進一步研究。

本研究結果玉米大斑病菌經菌塊繼代轉移和培養，第3代產孢量最多，從第3～10代產孢量隨著代數增加而遞減。劉海英等［16］研究認為，經連續單孢分離和培養，獲得玉米大斑病菌的22次繼代培養菌株，前13代菌株沒有明顯的生長和發育變化，從第14代開始，繼代培養對病菌的生長和發育存在顯著影響，隨著繼代次數增加，產孢量下降，本研究結果與其研究結果差異較大，原因可能是連續單孢分離和培養與菌塊繼代轉移和培養相比，菌株衰退較慢;也有可能兩者間供試的菌株本身存在較大的差異。

4 結論

利用單因素組配確定了促進玉米大斑病菌分生孢子產量增加的最佳谷物粒培養基配方為小麥100 g、甘露醇2.5 g、玉米葉15 g的9號培養基;該培養基在20℃、光暗交替各12 h，光照強度為2000 lx條件下，分生孢子產量最高;培養時間在11 d內，培養時間越長產孢量越高，第11天是玉米大斑病菌分生孢子產生量最多的時間，培養時間11～25 d，培養時間越長，產孢量越少;玉米大斑病菌經菌塊繼代轉移和培養，第3代產孢量最多，從第3～10代產孢量隨著代數增加而遞減。