甘草次酸對銀屑病患者角質形成細胞增殖、凋亡及miR?21表達的影響

鄭瑀心 閔敏 朱子羽 楊曉紅 曹毅 鄭敏

310053杭州，浙江中醫藥大學（鄭瑀心、朱子羽、楊曉紅、曹毅）；江蘇省常州市第一人民醫院皮膚科（閔敏）；浙江大學醫學院附屬第二醫院皮膚科（鄭敏）

甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）是甘草甜素的主要活性代謝產物，對多種腫瘤如肝癌、肺癌、宮頸癌、胃癌、結腸癌及白血病等來源的腫瘤細胞具有廣泛的抑制作用，并且對于正常體細胞的毒性較?。??2］。銀屑病是一種以表皮增殖和炎癥為特征的紅斑鱗屑性皮膚病。臨床上，以甘草甜素為主要成分的復方甘草酸苷片是銀屑病的輔助治療藥物，已經得到廣泛應用，并取得了良好的臨床效果。我們試圖通過研究甘草次酸對銀屑病患者角質形成細胞增殖、凋亡以及miR?21表達的影響，初步探討其治療作用機制，從而為臨床上甘草次酸有效治療銀屑病提供實驗依據，為銀屑病防治藥物的研發提供新的切入點。

材料與方法

一、材料與儀器

甘草次酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），角質形成細胞完全培養基（美國Life公司），MTS細胞增殖試劑盒（美國Promega公司），凋亡試劑盒、流式細胞儀（美國BD公司），逆轉錄試劑盒（美國Promega公司），SYBR熒光定量試劑盒（瑞士Roche公司），PCR儀（美國Bio?Rad公司），酶標儀（美國DYNEX公司）。

二、方法

1.銀屑病患者角質形成細胞分離及原代培養：本研究經浙江大學醫學院附屬第二醫院醫學倫理委員會批準（IRB?2016?023）。2016年9月至2017年10月在浙江大學附屬第二醫院收集確診為尋常性銀屑病的患者15例，其中男9例，女6例，年齡（40.21±12.38）歲。自患者皮損部位獲取皮膚標本，取材前患者均簽署知情同意書。將皮損標本保存于0.5%分離酶中，4℃過夜消化后，于超凈臺中分離表皮和真皮，表皮置于0.25%胰酶溶液中，37℃溫育10 min。以胎牛血清中止胰酶活性，吹打表皮，以200目濾網過濾角質形成細胞懸液，500×g離心5 min。棄上清液，加入10 ml角質形成細胞完全培養基，接種于75 cm2培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養箱中培養［3?4］，隔天換液，傳代2～3次后用于后續試驗。

2.MTS檢測甘草次酸對銀屑病角質形成細胞增殖的影響：取銀屑病角質形成細胞單細胞懸液，以1× 105個/ml的密度接種于 96孔板中，每孔100 μl。次日細胞貼壁后換培養液，待細胞融合度達90%時，根據前期預實驗結果，即甘草次酸對角質形成細胞的半抑制濃度（IC50）約為6 mg/L，予不同質量濃度（1、2、4、8、10 mg/L）甘草次酸干預，對照組加入含有0.01%二甲基亞砜（DMSO）的培養基。每個濃度設5個復孔，繼續培養24、48、72 h。行MTS細胞增殖實驗時，先將96孔板中培養基棄凈，設5個空白對照復孔，對照組、實驗組及空白對照組每孔均添加 100 μl角質形成細胞培養基及20 μl MTS，于37℃、5%CO2環境下孵育。1～4 h后，用酶標儀于540 nm波長處檢測各孔吸光度（A值）。

3.流式細胞儀檢測甘草次酸對銀屑病角質形成細胞凋亡的影響：取銀屑病角質形成細胞以1×105/ml（500 μl/孔）種于6孔板，待細胞融合至90%時，予甘草次酸干預，使終濃度為1、2、4、8和10 mg/L，對照組加入含有0.01%DMSO的培養基。作用24 h后收集細胞。按照BD公司Annexin V/PE和7AAD雙染細胞凋亡試劑盒說明書處理后，立即行流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

4.實時熒光定量PCR檢測銀屑病角質形成細胞miR?21表達水平：取銀屑病角質形成細胞以1×105/ml（500 μl/孔）種于6孔板，待細胞融合度達90%時，予甘草次酸干預，使終濃度為1、2、4 mg/L，對照組加入含有0.01%DMSO的培養基，作用24 h后，Trizol法提取總RNA。再取部分銀屑病角質形成細胞以1×105/ml（500 μl/孔）按上述方法接種于6孔板，予2 mg/L甘草次酸干預，作用18、24及48 h后，采用Trizol法提取總RNA。用miRNA cDNA合成試劑盒進行逆轉錄。設計合成引物，miR?21上游引物 5′?ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA?3′，下游引物5′?TGGTGTCGTGGAGTCG?3′；U6上游引物 5′?CTCGCTTCGGCAGCACA?3′，下游引物 5′?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3′。采用熒光定量PCR反應體系試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作，擴增miR?21和U6基因。以U6為內參進行定量分析，用2?ΔΔCt表示miR?21的表達量。ΔΔCt=（實驗組目的基因Ct-實驗組內參基因Ct）-（對照組目的基因Ct-對照組內參基因Ct）。實驗重復3次。

三、統計學分析

采用Graph Pad 6.0統計處理軟件分析。常規進行方差齊性檢驗、正態性檢驗。計量資料實驗數據以表示。采用單因素方差分析和重復測量的方差分析統計組間和組內差異，兩兩組間比較采用LSD檢驗；相關性用Pearson相關系數分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、甘草次酸抑制銀屑病角質形成細胞的增殖

圖1 甘草次酸對銀屑病患者角質形成細胞增殖的影響

見圖1。重復測量方差分析顯示，各濃度甘草次酸對銀屑病角質形成細胞體外增殖均有抑制作用，且抑制作用在不同時間點差異有統計學意義（F=2 294，P＜ 0.05），藥物作用時間越長，抑制作用越強；不同濃度組間增殖抑制率差異也有統計學意義（F=752.7，P＜ 0.05），甘草次酸濃度越高，抑制作用越強；藥物濃度與時間之間存在交互效應（F=45.46，P＜ 0.05）。

二、甘草次酸促進銀屑病患者角質形成細胞凋亡

見圖2。1、2、4、8、10 mg/L甘草次酸組與對照組間銀屑病角質形成細胞凋亡率差異有統計學意義（F=59.50，P＜0.05）。兩兩比較顯示，除1 mg/L甘草次酸組與對照組間差異無統計學意義外，其余各甘草次酸組與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。甘草次酸濃度與銀屑病角質形成細胞凋亡率之間呈正相關（r=0.922，P＜0.05）。

三、甘草次酸抑制銀屑病角質形成細胞miR?21的表達

實時熒光定量PCR顯示，銀屑病角質形成細胞分別經1、2、4 mg/L甘草次酸作用24 h后，miR?21表達水平分別為0.24±0.04、0.22±0.07、0.17±0.05，與對照組（0.92±0.12）相比，差異有統計學意義（F=213.10，P＜ 0.05）；兩兩比較顯示，1、2、4 mg/L甘草次酸組較對照組miR?21基因表達均顯著降低（P＜ 0.01）。2 mg/L作用18、24、48 h時，miR?21表達水平分別為0.55±0.02、0.22±0.06、0.15±0.06，與對照組（0.98±0.02）相比，差異有統計學意義（F=238.10，P＜0.05）；與對照組比較，2 mg/L甘草次酸處理不同時間均可降低miR?21基因表達（P＜0.01），且甘草次酸干預時間與miR?21表達量之間呈負相關（r=-0.949，P＜0.05）。

討 論

已有學者發現，甘草次酸可抑制HaCaT細胞的增殖［5］。本研究顯示，甘草次酸還可明顯抑制銀屑病角質形成細胞的增殖，誘導細胞凋亡，且隨著藥物濃度增加，凋亡率升高。因此，我們推測甘草次酸可能通過誘導細胞凋亡，抑制銀屑病患者角質形成細胞增殖。

圖2 甘草次酸處理24 h后對銀屑病角質形成細胞凋亡的影響 右上象限代表晚期凋亡細胞

近來，miR?21被發現在炎癥、腫瘤性疾病中發揮重要作用。Ahmed等［6］發現，在皮膚原代角質形成細胞及HaCaT細胞中，miR?21通過抑制骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein）依賴的抑癌基因PTEN、PDCD4、TIMP3和TPM1等的表達促進細胞增殖與遷移。國外學者還發現，miR?21在銀屑病患者皮損區角質形成細胞中高表達，提示其與增殖相關，在銀屑病的發病機制中可能發揮重要作用［7?8］。我們既往研究發現，清熱涼血方對外周血miR?21的下調可能是其治療銀屑病的作用機制之一［9］；紫草素可明顯抑制表皮生長因子對HaCaT細胞的促增殖作用，其機制可能為通過抑制miR?21的表達，達到抑制HaCaT細胞增殖的作用［10］。而且，甘草次酸可以抑制HaCaT細胞miR?21的表達［11］。但是目前尚無甘草次酸對銀屑病患者原代角質形成細胞miR?21表達作用的研究報道。我們采用實時熒光定量PCR檢測發現，甘草次酸抑制銀屑病患者角質形成細胞中miR?21的表達。既往研究提示，miR?21在銀屑病皮損區高表達，且與細胞增殖相關［7，12］。因此我們推測，甘草次酸對銀屑病患者角質形成細胞miR?21表達的抑制可能與其細胞增殖抑制效應相關。然而，既往研究提示，多種miRNA參與銀屑病發病，如miR?31、miR?103等［8，13］，這些都是銀屑病皮損區活躍的生物標記物，而本研究僅圍繞miR?21展開部分研究，因此，有關甘草次酸在銀屑病治療中的作用機制仍有待進一步研究。

綜上，本實驗以甘草次酸作為干預因素，以銀屑病患者角質形成細胞為研究對象，證明甘草次酸抑制銀屑病患者角質形成細胞的增殖，并誘導其凋亡，此外，甘草次酸明顯抑制了增殖相關標記物miR?21的表達，為甘草次酸制劑治療銀屑病提供了實驗依據。