固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質譜法同時測定飼料中5種雌激素

房克艷，趙超敏，鄧曉軍，陳沁

（1.上海大學生命科學學院，上海 200444）

（2.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135）

雌激素是一種具有廣泛生物學活性的類固醇化合物。如雌二醇、雌三醇等，具有促進和維持女性生殖器官和第二性征的生理作用，并對內分泌、心血管、代謝系統、骨骼的生長和成熟等均有明顯的影響。另外，人工合成的雌激素，如己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚等，也具有干擾激素系統功能的作用。雌激素添加到飼料中可促進雌性動物排卵以提高發情動物的數量和受胎率；還具有促進動物生長和增加脂肪沉積等作用[1]。但是，飼料中雌激素類藥物的濫用或違法使用，會導致動物性食品中雌激素的殘留，從而對人類健康產生危害[2]。農業部發布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》（農業部公告第193號）中[3]，明確禁止使用雌激素；歐盟的報告中也表明，激素類獸藥殘留不僅會擾亂人體內分泌、生長發育、免疫系統和生殖系統等方面的功能，還會直接危害人們的健康甚至生命[4]。

飼料是畜禽攝入外源性雌激素的主要途徑，長期飼喂含有雌激素的飼料，會使其在畜禽體內累積。若人類食用含有雌激素的動物性食品，可擾亂人體的內分泌系統，導致女性性早熟、男性生育能力下降、女性乳腺癌和宮頸癌等[5,6]。因此，要加強飼料中雌激素的檢測和監管。目前對于雌激素檢測方法的報道，大多為動物性食品中[7,8]和環境中[9,10]，而對于飼料中雌激素的檢測方法相對較少。飼料中激素檢測的方法主要有氣相色譜-串聯質譜法[11,12]、高效液相色譜法[13,14]、酶聯免疫法[15]、液相色譜-串聯質譜法[16,17]。氣相色譜法在檢測時需要對樣品進行衍生化，操作繁瑣、耗時長；高效液相色譜法和酶聯免疫法的靈敏度低、選擇性差、受基質影響相對較大；液相色譜-串聯質譜的方法分析范圍廣、選擇性好、靈敏度高、分析結果可靠，既可定性、又可定量，是對飼料中雌激素進行快速檢測分析的首選方法。對飼料中獸藥的檢測，目前報道最多的為雌酮，己烯雌酚，雌三醇等[10,14,18]，未見有對飼料中雙烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、17α-雌二醇和17β-雌二醇5種激素同時檢測的報道。本文采用簡單快速的固相萃取方法對飼料樣品進行凈化，通過優化提取和凈化的前處理過程，提高回收率，降低基質效應；同時，還優化了液相色譜條件，使17α-雌二醇與同分異構體17β-雌二醇實現良好分離，建立了靈敏度高，準確、可靠的飼料中雌激素的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜配QTRAP6500質譜，購自美國AB Sciex公司；漩渦振蕩器，購自德國Heidolph公司；Supelco固相萃取裝置，購自美國Supelco公司；Athena C18-WP色譜柱色譜柱，購自上海安譜科學儀器有限公司；Poly-Sery Max（60 mg，30 mL）固相萃取柱，購自上海安譜科學儀器有限公司；往復式振蕩器，購自日本Yamato公司；全自動氮吹儀，購自美國Caliper公司；低溫離心機，購自美國Sigma公司；移液器，購自法國Gilson公司。

激素標準品：雙烯雌酚（DE，純度 96.6%）、己烯雌酚（DES，純度 97.41%）、己烷雌酚（HEX，純度 99.8%）、17α-雌二醇（α-E，純度 99.7%）和 17β-雌二醇（β-E，純度99.9%），均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；17β-雌二醇-D3（β-E-D3，純度99.9%），購自美國o2si公司；己烯雌酚-D8（HEX-D8，純度98.2%），購自加拿大TRC公司；乙醚、甲醇、三氯甲烷、叔丁基甲醚、乙腈和正己烷（HPLC級），均購自美國TEDIA公司；乙酸銨、三氯乙酸、無水氯化鈉和氫氧化鈉（分析純），均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 標準溶液的制備

儲備液：分別準確稱取雙烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、17α-雌二醇、17β-雌二醇、己烯雌酚-D8和17β-雌二醇-D3各1.00 mg（精確到0.01 mg），以甲醇配制濃度為 100.0 mg/L的單標溶液，密封，于棕色瓶中-30 ℃儲存。

單標中間工作液：分別移取0.1 mL100.0 mg/L的單標儲備液，以甲醇配制濃度為1.0 mg/L的單標中間工作液，密封，于棕色瓶中-30 ℃儲存，備用。

混合標準工作液：使用前分別移取一定量 1.0 mg/L的單標中間工作液，用甲醇配制為100.0 μg/L的混合標準溶液，密封，于棕色瓶中-4 ℃儲存。用乙腈/水（1:1，V/V）配制 0，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/L 濃度梯度的混合標準溶液，其中兩種內標的添加濃度均為10.0 μg/L，現用現配。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

Athena C18-WP色譜柱（2.1×150 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進樣體積10 μL；流動相A為0.25‰氨水，B為100%乙腈；洗脫程序：0～3 min，35%～50% B；3.0～6.5 min，50%～55% B；6.5～7.0 min，55%～99%B；7.0～9.0 min，99% B；9.0～9.1 min，99%～50% B；9.1～10.0 min，50%～35% B，保持4 min，流速為0.30 mL/min。

1.3.2 質譜條件

電離模式：電噴霧電離負離子模式（ESI-）；多反應監測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：-4500 V；霧化氣壓力（GS1）：50 V；氣簾氣壓力（CUR）：35 V；輔助氣流速度（GS2）：60 V；離子源溫度500 ℃；碰撞氣（CAD）：Medium；入口電壓（EP）：-10 V；其它條件見表1。

表1 5種雌性激素及兩種內標的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters for five estrogens and two internal standards

1.4 樣品處理

稱取5 g（精確到0.01 g）飼料樣品于50 mL具塞塑料離心管中，準確加入100 μL 100.0 μg/L己烯雌酚-D8、和17β-雌二醇-D3內標，均質5 min，加入10 mL0.2 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH=5.2±0.2），渦旋30 s。加入10 mL乙醚、700 μL 10%三氯乙酸，渦旋30 s，加入5.0 g無水氯化鈉，渦旋30 s，振蕩提取5 min，4500 r/min離心5 min，吸取乙醚層于另一試管中。乙醚重復提取一次，合并的乙醚相在常溫下用氮氣吹至近干。加入2 mL三氯甲烷溶解殘余物，渦旋1 min，加入5 mL 1.0 mol/L氫氧化溶液，渦旋1 min，4500 r/min離心3 min，將上層水相移入另一試管中。氫氧化鈉溶液重復提取一次，合并氫氧化鈉溶液提取液，待凈化。

1.5 凈化

固相萃取柱使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，合并氫氧化鈉提取液過固相萃取柱，依次用5 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液和5 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液/水（7:3，V/V）淋洗固相萃取柱，待溶液流過固相萃取柱后，減壓抽干。加入5 mL 2%甲酸-叔丁基甲醚/甲醇溶液洗脫（9:1，V/V），收集洗脫液，流速均應控制在2 mL/min。洗脫液在低于40 ℃下，用緩和氮氣流吹干，加入1 mL乙腈-水溶液（1:1，V/V）溶解殘渣，加入1 mL乙腈飽和正己烷溶液，渦旋混勻30 s，轉移至2 mL連蓋塑料離心管中，于4 ℃ 15000 r/min離心3 min，取下層溶液過0.22 μm濾膜，待測定。

1.6 數據統計分析

數據處理采用Microsoft Excel 2010，圖表的繪制采用GraphPad Prism 6和Origin 9.0軟件。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

質譜條件均在兼顧所有目標化合物具有良好響應的情況下進行優化。將100.0 μg/L的單標準溶液用流動注射泵連續注射入質譜儀，分別在正、負離子模式下進行一級質譜全掃描，確定母離子。

將化合物的二級質譜豐度較高的兩個碎片離子用于定性和定量（圖1），再優化每一種化合物的DP、CE和CXP參數。

結果顯示：5種雌激素在負離子模式下的質譜響應值更高。由于5種雌激素均具有羥基，呈現弱酸性，易脫氫在負離子模式下獲得[M-H]-的準分子離子峰。因此，選擇負離子模式進行電離。

圖1 5種雌激素及2種內標的二級質譜圖Fig.1 Product ion spectra of five estrogens and two internal standards

2.2 色譜條件優化

為實現5種雌激素的有效分離，在相同質譜條件下，流動相分別選擇水-乙腈、水-甲醇。結果顯示，用水-乙腈作為流動相，更有利于5種激素的離子化。在水相中添加一定量的氨水，有利于調節pH，改善峰形，由于5種雌激素呈現弱堿性，添加少量的堿性物質，有利于雌激素解離成離子狀態，消除峰拖尾的現象。分別考察了氨水添加濃度為 0.10‰，0.15‰，0.20‰，0.25‰，0.30‰的效果。結果表明，添加濃度為0.10‰時，作用不明顯；添加濃度在0.15‰～0.25‰范圍內，隨著氨水添加量的增多，峰型逐漸變窄且無拖尾現象；繼續增加添加量時，峰形變化不明顯，考慮到色譜柱的使用壽命，選擇了0.25‰的添加濃度。由于17α-雌二醇和17β-雌二醇互為同分異構體，質譜條件相同，僅靠質譜條件無法實現有效分離，17α-雌二醇和17β-雌二醇的保留時間均在5～6 min，有機相所占比例在55%左右，且兩個峰交接出現重疊，因此，必須優化色譜條件來獲得良好的分離度。結果顯示，通過優化流動相的洗脫梯度，能夠實現兩個峰的有效分離（圖2）。另外，對比了流速為0.20 mL/min、0.25 mL/min、0.30 mL/min和0.35 mL/min的分離效果，確定流速為0.30 mL/min時的效果最佳。

圖2 5種雌激素和2種內標的二級質譜提取離子流圖Fig.2 MS/MS extraction ion spectra of the five estrogens and the two internal standards

2.3 樣品的提取和凈化方法的選擇

圖3 不同提取溶劑對回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on recovery

提?。河捎?種雌激素在弱極性和中等極性的溶劑中均具有良好的溶解性，因此選擇了乙醚（DEE）、乙酸乙酯（EA）、叔丁基甲醚（MTBE）和乙腈（ACN）作為提取溶劑進行提取。結果顯示，以上4種溶劑的提取回收率分別在 85.80%～101.95%、92.86%～117.23%、75.14%～104.60%和 55.40%～174.20%（圖3）；乙醚和叔丁基甲醚除色素的效果良好；乙腈除蛋白能力稍強。但是，經叔丁基甲醚提取的樣品，質譜響應值低，且峰形亂，表明提取時基質共提物較多；乙腈對17β-雌二醇和己烷雌酚的提取效果差，回收率低；乙酸乙酯提取液中基質共提物多，氮吹時不易吹干?？紤]到回收率、基質效應和提取效率等綜合效果，最終選擇乙醚作為提取溶劑。

濃縮飼料、配合飼料、精料補充料等飼料中含有大量的蛋白質，如果不去除干凈，不僅會產生沉淀物和氣泡，堵塞固相萃取小柱，影響凈化效果；而且會損傷儀器?？疾炝?500 μL、600 μL、700 μL、800 μL、900 μL和1000 μL 10%三氯乙酸除蛋白的效果。結果顯示，當添加量為500 μL時，提取液中仍有絮狀蛋白沉淀，堵塞萃取小柱，過柱困難；當添加量為600 μL時，提取液中有少量氣泡，影響萃取效率；當添加量為900 μL及以上時，由于三氯乙酸添加量過多，使蛋白迅速沉淀、凝結，容易將目標物包裹在其中，導致雌激素的回收率低；添加量為700 μL和800 μL時，除蛋白效果差別不大，且前者目標物的回收率更高。因此，選擇添加700 μL 10%三氯乙酸去除基質中的蛋白質。另外，對比了2 mL、5 mL、8 mL、10 mL、15 mL和20 mL的提取溶劑對回收率的影響。結果顯示，除己烷雌酚外，提取溶劑體積在2～10 mL范圍內，回收率均呈現上升的趨勢，且10 mL、15 mL和20 mL之間對回收率的影響效果無明顯差別（圖4）。當提取溶劑體積低于10 mL時，己烷雌酚，質譜峰寬而亂，重復性差；當提取溶劑體積≥10 mL時，峰形明顯改善，重復性好。因此，為節省溶劑和提高檢測效率，選擇提取溶劑體積為10 mL。

圖4 不同體積提取劑對回收率的影響Fig.4 Effect of different volume extractants on recovery rate

凈化方法：采用固相萃取的凈化方法，分別用HLB和Max小柱對提取液進行凈化。結果顯示，HLB小柱對17α-雌二醇和17β-雌二醇有較好的凈化效果，回收率在71.90%～116.30%范圍內，但對其它3種雌激素的凈化效果均不理想，峰寬且響應值低；而Max柱不僅能夠良好的去除飼料基質中的色素和有機酸，而且對5種雌激素的凈化效果好，過柱速度快，回收率均在76.30%～114.38%之間。因此，選擇Max柱作為固相萃取小柱。

2.4 線性關系、檢出限和定量限

按照1.2中的方法將混合標準溶液逐級稀釋，配成系列混合標準工作液，按照本方法依次進行測定，以得到的目標物質的峰面積與加入內標的峰面積的比值為縱坐標（y），對應目標物質的濃度與內標物質的濃度的比值為為橫坐標（x），繪制工作曲線。

由表 2可以看出，該方法的線性相關系數均在0.999以上，線性關系良好。以信噪比（S/N）≥10所對應的待測物濃度為該方法的定量限（LOQ），5種雌激素的LOQ均為1 μg/kg。

表2 5種雌激素的線性方程、線性范圍、線性相關系數Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r) of 5 compounds

2.5 回收率與精密度

單一植物源飼料、飼料添加劑、濃縮飼料、配合飼料和精料補充料空白樣品，分別添加 1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg標準物質，按照1.4和1.5的方法對加標樣品進行前處理和凈化，每個水平平行測定6次，其加標回收率均在70.20%～114.37%之間，相對標準偏差為 0.15%～9.08%，保留時間的可變性小于 1%。該方法準確度和精密度符合飼料中激素殘留檢測的要求。

表3 5種雌激素的加標回收率和相對標準偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSD, n=6) of five estrogens spiked in feed samples

2.6 實際樣品分析

采用所建方法對法定監管的5種飼料分別抽取10個樣品進行檢測分析，均未檢出上述5種激素。

3 結論

本文建立了飼料樣品中17α-雌二醇、17β-雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、和雙烯雌酚的超高效液相色譜-三重四極桿質譜（UPLC-MS/MS）的方法。該方法簡單、快速，靈敏度高；前處理凈化效果好，能有效的降低基質效應；應用范圍廣，可作為飼料中5種雌激素的常規檢測方法。