黃芪甲苷通過調控miR-33a及ABCA1信號發揮抗動脈粥樣硬化作用*

秦合偉， 李彥杰， 張志鑫， 任 錕， 李斯錦， 盧永保

(1河南省中醫院， 河南中醫藥大學第二附屬醫院， 2河南中醫藥大學， 河南 鄭州 450002)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病最主要的基礎病理改變，目前認為AS與內皮細胞損傷、脂質紊亂、免疫應答和與其相關的慢性炎癥反應有密切關系。AS發病機制和病理的復雜性給臨床的治療和預防帶來一定的困難。微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)是一類高度保守的非編碼小RNA，它通過與靶標基因的3’非翻譯區(3’-untranslated region，3’-UTR)靶向結合，從而降解靶基因的mRNA，或靶向結合后抑制蛋白質翻譯，最終達到調控基因表達的目的。miR-33a位于固醇調節元件結合蛋白2(sterol regulatory element binding protein2，SREBP2)基因的第16位內含子中，在哺乳動物的體內具有高度保守性。miR-33a的主要靶基因是三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)。ABCA1是介導細胞膽固醇流出的主要膜轉運體。既往有研究表明，miR-33a通過抑制ABCA1的表達，減少細胞內膽固醇的流出，導致泡沫細胞的形成[1-2]。

黃芪是傳統中藥的一種，在心血管疾病的治療中應用廣泛，其主要化學成分包括苷類、多糖和氨基酸等，是一種天然的抗氧化劑；黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-IV)是一種提取分離自中藥黃芪的單體化合物。本課題組前期研究發現，黃芪甲苷具有改善脂質代謝紊亂，調控基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)與其受體(C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4)的生物信號，抑制主動脈粥樣斑塊SDF-1和CXCR4的mRNA和蛋白表達，以及調控骨髓源性內皮祖細胞CXCR4的mRNA和蛋白表達的作用[3]；能夠通過調控磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路，抑制炎癥反應，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成[4]。本研究旨在觀察黃芪甲苷調節血脂抑制動脈粥樣硬化的作用機制是否與調控miR-33a，進而影響ABCA1的信號表達，促進巨噬細胞內膽固醇流出有關。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、藥物與試劑

人單核巨噬細胞系THP-1購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；本實驗所用C57BL/6J小鼠購自中國科學院上海生命科學研究所，12只作為正常(normal)組；ApoE-/-小鼠購自南京大學模式動物研究所，動物許可證號為SCXK(蘇)2010-0001,共24只，SPF級，8周齡，體質量(18±2)g，雄性；SD大鼠來源于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號為SCXK(滬)2003-0003，20只，雄性，體質量(300±20)g。所有動物飼養于河南中醫藥大學SPF級動物實驗中心。

黃芪甲苷原料藥(純度>98%，批號 84687-43-4購自南京春秋生物工程有限公司)；miR-33a模擬物(miR-33a mimic)購自廣州銳博公司；兔抗人ABCA1 I抗以及佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)購自Sigma；抗GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 II 抗購自杭州賢致公司；總RNA抽提試劑盒、總RNA逆轉錄試劑盒、ABCA1蛋白定量試劑盒和RT-PCR試劑盒購自TaKaRa；RNA逆轉錄試劑盒購自Fermentas；蛋白提取試劑盒購自碧云天公司；氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)購自廣州瑞博生物科技有限公司；其余試劑為國產或進口分析純。

2 實驗方法

2.1黃芪甲苷含藥血清的制備 將20只SD大鼠隨機分為2組，即空白(blank)組和黃芪甲苷(AS-IV)組,空白組給予蒸餾水灌胃，黃芪甲苷組給予黃芪甲苷(40 mg/kg)灌胃，每日1次，連續1周。1周后，腹主動脈取血，12 000×g高速離心10 min，取上清液，56 ℃滅活， -80 ℃保存備用[4]。

2.2細胞培養及分組 THP-1細胞用160 nmol/L的PMA處理24 h，使其誘導分化為巨噬細胞，再用50 mg/L oxLDL孵育使其變成泡沫細胞作為實驗模型。THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞換無血清培養基培養，按照實驗設計，分為空白血清(blank serum)組、黃芪甲苷含藥血清(AS-IV-containing serum)組及黃芪甲苷含藥血清+miR-33a mimic聯合處理(combined)組。miR-33a mimic轉染方法：在無菌條件下，用含有10% FBS的DMEM細胞培養基，將巨噬細胞(1×108/L)接種于6孔板，每孔含有2 mL培養基；在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育片刻，備用；取miR-33a mimi (20 μmol/L) 0.6 μL和HiPerFect轉染試劑12 μL滴加入300 μL的不含FBS和抗生素的DMEM細胞培養基，混合均勻，使其終濃度為5 nmol/L；在室溫條件下(15～25 ℃)，放置 5～10 min，直至形成轉染復合物；將轉染復合物分別均勻滴入上述接種巨噬細胞的培養基中，混合均勻；在37 ℃、 5% CO2細胞培養箱中孵育24 h后，更換含ox-LDL (5 mg/L)的低糖DMEM細胞培養基，在37 ℃、 5% CO2細胞培養箱中孵育，備用，等到巨噬細胞的融合度約達到80%時，終止細胞的培養。

2.3體內實驗

2.3.1造模與給藥 所有小鼠進行適應性飼養1周后，ApoE-/-小鼠給予高脂飼料(含脂肪21%和膽固醇0.15%)，C57BL/6J小鼠12只作為正常(normal)組，各組均予以自由飲水。于飼養4周(主動脈壁可見明顯的斑塊形成為造模成功)后將24只ApoE-/-小鼠按照隨機分組方法分為2組：模型(model)組和黃芪甲苷(AS-IV)組，每組12只。于12周齡起，黃芪甲苷組給予黃芪甲苷(40 mg/kg，按中等劑量，1 倍成人臨床等效量)灌胃；正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃[4]。

2.3.2樣品采集與處理 各組動物連續給藥12周后取材，取材前小鼠禁食12 h，無菌條件下，迅速打開胸腔和腹腔，沿主動脈瓣至髂動脈分支處剝離全長主動脈。

2.3.3病理形態學觀察 主動脈經過乙醇梯度脫水、透明、浸蠟包埋后切片，厚度設定為4 μm，采用常規HE染色法進行切片染色，應用光學顯微鏡進行觀察。

2.3.4Real-time PCR檢測主動脈中miR-33a和ABCA1 mRNA的表達 將小鼠主動脈組織稱取質量后，加入適量的TRIzol，按試劑盒說明書提取總RNA。取10 μL總RNA，加入4 μL 5×RT緩沖液、1 μL隨機引物d(N)6、2 μL 10 mmol/L dNTP、1 μL 無RNase的DNase I和1 μL(40 U) RNase抑制劑，置于金屬浴鍋上，37 ℃ 30 min、 75 ℃ 10 min，去除殘余的基因組DNA，立即冰浴，隨后加入0.25 μL RNasin和1 μL ReverTra Ace再行逆轉錄(25 ℃ 10 min、42 ℃ 1 h、 75 ℃ 10 min、 4 ℃保存)得到cDNA。 PCR條件為：95 ℃ 5 min; 95 ℃ 15 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s, 3個循環；95 ℃ 15 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s、79 ℃ 10 s，40個循環，79 ℃測熒光；55 ℃～95 ℃，每個循環加0.5 ℃，檢測熔解曲線[4-5]。PCR結果定量用2-ΔΔCt法，ΔCt=目的基因Ct-內參照基因Ct，以正常組作為對照樣本，ΔΔCt=觀察樣本ΔCt-對照樣本ΔCt。樣本的相對表達量=2-ΔΔCt。ABCA1的上游引物序列為5’-GTCAACCTCTACAGCAGCGT-3’，下游引物序列為5’-CTATCGGGGTAAAGGCGGTC-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-AGCTCGCCTCTAGCTGCTGAC-3’， 下游引物序列為5’-TGTACACAGGTAAACACGTCTG-3’。

2.3.5Western blot檢測各組小鼠主動脈ABCA1的蛋白表達 取小鼠主動脈，用PBS沖洗3次，洗去殘血，磨碎勻漿后加入蛋白裂解液裂解蛋白，于4 ℃、 1 000×g離心10 min，小心吸取上清液，用BCA法進行蛋白質定量。采用G250-Bradford蛋白濃度測定法對蛋白進行定量。提取的蛋白質樣品經定量后，加入適量上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min使蛋白質變性，于SDS-PAGE分離蛋白，用恒定電流轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉，加入相應濃度的 I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次；加入 II 抗，室溫孵育，TBST洗滌3次。用堿磷酶化學發光進行顯色，觀察ABCA1蛋白質表達的變化，以β-actin為內參照，目的蛋白表達條帶密度與β-actin條帶密度的比值即為相對表達量[4-5]。

2.4體外實驗

2.4.1Real-time PCR檢測細胞miR-33a的表達 用空白血清和不同濃度(3、10和30 mg/L)黃芪甲苷含藥血清處理THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞24 h，或用10 mg/L黃芪甲苷含藥血清處理THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞不同時間(0、6、12和24 h)，提取細胞RNA。miR-33a上游引物為5’-GUUGUUGCUAGUUGCGUUG-3’，下游引物為5’-GUGUGUAGUUGUUGCAUUG-3’；U6的上游引物序列為5’-AGCTCGCTGTGAGCTGCTGC-3’,下游引物序列為5’-CAGTTGCCAGTCGTCGAGGT-3’。PCR參數為：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s、55 ℃ 10 s，40個循環。設U6 為內參照，其相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

2.4.2Real-time PCR和Werstern blot檢測細胞ABCA1的表達 用空白血清和高、中、低3個濃度的含藥血清處理THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞24 h后收集細胞，real-time PCR檢測方法同上。Werstern blot檢測方法：用各組血清處理THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞24 h后收集細胞，PBS洗滌3次，用蛋白裂解液裂解總蛋白，提取蛋白，經定量后，加入緩沖液，加熱使蛋白質變性，電泳分離蛋白，轉膜至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉，加入相應濃度的 I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次;加入II抗，室溫孵育，TBST洗滌3次；用堿性磷酸酶化學發光進行顯色。使用ImageJ 的軟件分析條帶灰度值[4, 6]。

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2.4.3油紅O染色檢測細胞內脂質含量 將細胞接種于48孔板，誘導分化和BPA處理，隔日應用PBS液洗滌3次，采用4%多聚甲醛固定10 min，后吸棄培養液，加入固定液；PBS液洗滌3次，加入油紅O染色液15 min后，用蘇木精染色5 min，10 mL/L HCl分化，水沖洗至變藍，雙蒸水沖洗后甘油明膠封片。倒置顯微鏡下觀察，可見細胞內脂質呈紅染，細胞核呈藍染，顯微鏡拍照[2]。

2.4.4高效液相色譜法檢測細胞內膽固醇含量 參照文獻方法[2]收集細胞，加入氯化鈉200 μL，采用冰浴中超聲使細胞破碎，用BCA法測定蛋白含量后，使用三氯乙酸(6%)沉淀，去除蛋白，取上清液進行膽固醇檢測。取100 μL上清液，加入氫氧化鉀溶液(8.9 mol/L)200 μL，水解膽固醇酯后作為細胞內總膽固醇待測樣品。將樣品分別與內標液(豆甾醇)混勻，用正己烷和異丙醇(3 ∶2，V/V)溶液和無水乙醇抽提后真空干燥。上樣前用100 μL乙腈和異丙醇(70∶30，V/V)溶解樣品，采用C-18柱，溫度為室溫，流速1 mL/min，檢測波長為250 nm，以峰面積定量膽固醇，內標校準，以mg/(g protein)為單位。

2.4.5[3H]法檢測細胞內膽固醇流出 細胞先在正常培養液中和7.4 MBq/L [3H]膽固醇共同孵育24 h，用PBS液洗滌細胞后置含脂蛋白的無血清培養液中再培養24 h。PBS液漂洗細胞3次，加入閃爍液裂解細胞，用液閃計數法檢測培養液和細胞中的[3H]膽固醇的含量[2]。膽固醇流出率(%)=培養液閃爍計數/總閃爍計數(培養液閃爍計數+細胞閃爍計數)×100%。

3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。實驗數據經正態性、方差齊性檢驗，符合條件后，多組樣本間比較采用單因素方差分析，各組間均數比較采用LSD-t檢驗和q檢驗；當實驗數據不符合正態性、方差齊性時, 采用秩和檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 體內實驗

1.1一般情況 飼養和灌胃過程中ApoE-/-小鼠死亡1只，剔除離群值，最后進入統計的各組小鼠數量各為10只。

1.2各組小鼠主動脈病理形態觀察 光學顯微鏡觀察可見正常組小鼠主動脈壁厚薄均勻，主動脈內膜光滑平整，內膜各層結構正常，未發現明顯的動脈粥樣硬化病灶;模型組光鏡下可見動脈管腔不平，管腔內膜顯著增厚,管壁厚度和斑塊截面積顯著大于正常組;黃芪甲苷組的主動脈壁各層結構正常，局部可見小灶性的鈣化顆粒物沉積，可見較小斑塊，病變程度明顯較輕,見圖1。

Figure 1.Pathological changes in the aorta of mice in each group (HE staining, ×200).

1.3黃芪甲苷對小鼠主動脈miR-33a及ABCA1 mRNA和蛋白表達水平的影響 藥物干預后，黃芪甲苷組小鼠主動脈的miR-33a表達量降低, ABCA1的mRNA和蛋白相對表達量均升高(P<0.05),表明隨著黃芪甲苷對miR-33a的抑制，ABCA1水平逐漸上升，見表1、圖2。

表1 黃芪甲苷對小鼠主動脈miR-33a及ABCA1 mRNA和蛋白表達水平的影響

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.

Figure 2.The protein expression of ABCA1 in mouse aorta of each group determined by Western blot.

2 體外實驗

Figure 3.Observation of the toxicity effects of astragaloside-containing serum on the viability of THP-1 macrophages. Mean±SD. n=6.

2.2黃芪甲苷含藥血清對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞miR-33a表達的影響 分別用空白血清和不同濃度的黃芪甲苷含藥血清處理THP-1巨噬細胞24 h，real-time PCR檢測結果顯示，不同濃度的黃芪甲苷含藥血清處理后，細胞中miR-33a表達均較空白血清組下調(P<0.05或P<0.01)，見圖4。用黃芪甲苷含藥血清處理THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞不同時間，real-time PCR檢測結果顯示，與0 h組相比，處理12 h組細胞的miR-33a 表達出現下調，處理24 h組細胞的miR-33a 表達下調更為明顯(P<0.01)，見圖5。

2.3miR-33a在黃芪甲苷含藥血清上調THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1表達中的作用 與空白血清組相比，黃芪甲苷含藥血清組細胞ABCA1的mRNA和蛋白水平均明顯上調(P<0.05)；而與含藥血清單獨處理組相比，聯合處理組細胞ABCA1的mRNA和蛋白水平均明顯下調(P<0.05)，見表2、圖6,提示THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞miR-33a的過表達可明顯抑制黃芪甲苷上調細胞ABCA1表達的作用。

Figure 4.The effect of different concentrations of AS-IV-containing serum on the expression of miR-33a in THP-1 macrophage-derived foam cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05，**P<0.01 vs blank serum group.

Figure 5.The effect of astragaloside-containing serum on the expression of miR-33a in THP-1 macrophage-derived foam cells for different times. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs 0 h group.

表2 各組THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1表達水平的比較

*P<0.05vsblank serum group;#P<0.05vsAS-IV-containing serum group.

2.4miR-33a在黃芪甲苷含藥血清減少THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞脂質蓄積中的作用 油紅O結果顯示，與空白血清組相比，黃芪甲苷含藥血清單獨處理組細胞內紅色脂滴明顯減少，而加入80 nmol/L miR-33a mimic共同處理后，細胞內的紅色脂滴又明顯增多,見圖7。HPLC檢測結果顯示，與空白血清組比較，黃芪甲苷含藥血清處理組細胞內總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯均明顯減少；而聯合處理組與黃芪甲苷含藥血清處理組相比，細胞內總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯的含量則明顯增加(P<0.05)，見表3。

Figure 6.The protein expression levels of ABCA1 in the THP-1 macrophage-derived foam cells of each group determined by Western blot.

Figure 7.The lipid accumulation of THP-1 macrophage-derived foam cells in different groups (Oil O red staining, ×200).

表3 miR-33a在黃芪甲苷含藥血清減少THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞脂質蓄積中的作用

*P<0.05vsblank serum group;#P<0.05vsAS-IV-containing serum group.

2.5miR-33a在黃芪甲苷含藥血清促THP-1巨噬細胞源性泡沫膽固醇流出中的作用 與空白血清組相比，黃芪甲苷含藥血清處理使細胞膽固醇流出明顯增加(P<0.05),而加入80 nmol/L miR-33a mimic共同處理細胞后，黃芪甲苷含藥血清促膽固醇流出作用被明顯抑制(P<0.05)，見圖8。

Figure 8.The role of miR-33a in cholesterol efflux in AS-IV-containing serum-induced THP-1 macrophage-derived foam cells. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs blank serum group; #P<0.05 vs AS-IV-containing serum group.

討 論

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病最常見病理基礎改變，隨著AS的病理生理機制研究的深入和化學藥物的不斷研發與應用，其相關疾病的發病率與死亡率有所下降，然而由于其病理機制的復雜性，臨床防治特別是其早期的防治，更需要繼續研究，具有深遠意義。目前，miRNAs在脂質代謝中的調節作用日益得到重視， miRNAs是一類高度保守的非編碼小RNA，它介導的基因表達是機體內一個廣泛存在的基因表達調控方式，miRNA通過與靶標基因的3’UTR靶向結合而降解靶基因的mRNA，或靶向結合后抑制蛋白質翻譯，最終達到調控基因表達的目的。研究顯示，miRNA在心血管系統中高度表達，尤其在AS中起重要的作用[7]。研究表明，參與AS 脂質代謝的miRNA，包括miR-122、miR-370、miR-378/378*、miR-335、miR-27、miR-125a-5p 和miR-33 等[8]，靶基因包括ABCA1、NPC1、ABCG1、SREBP和PPARγ等[9],其中miR-33通過調控ABCA1表達，影響膽固醇逆向轉運在脂質代謝中發揮重要作用。研究表明，在膽固醇平衡的調節中，miR-33通過靶向ABCA1、ABCG1和NPC1發揮作用[1， 10-11]。

在人體中存在2種miR-33，miR-33b位于第17號染色體SREBP1基因的17號內含子區域，其宿主基因可選擇性調控脂肪酸和三酰甘油的合成；miR-33a則位于SREBP2基因的第16位內含子中，其宿主基因控制著細胞內的膽固醇合成和攝取，在哺乳動物體內高度保守，其主要靶基因是ABCA1。ABCA1是介導細胞膽固醇流出的主要膜轉運體，研究表明，miR-33a可抑制ABCA1表達，減少細胞內膽固醇流出，導致泡沫細胞的形成[3]。

隨著對動脈粥樣硬化的研究日漸廣泛和深入，中醫藥的療效和優勢逐漸受到重視，學術界將熱點指向如何揭示AS的發展演變及中藥防治AS的具體作用機制。黃芪在中國傳統醫學中應用廣泛，尤其是在心血管疾病，黃芪甲苷是自黃芪中提取分離的單體化合物[12]，目前，對黃芪甲苷在治療心血管疾病方面進行了多項研究并取得了一定的進展。本課題組前期研究表明，黃芪甲苷具有改善脂質代謝紊亂，抑制主動脈粥樣斑塊SDF-1和CXCR4表達含量，抑制主動脈粥樣斑塊SDF-1和CXCR4 mRNA和蛋白表達，以及抑制骨髓源性內皮祖細胞CXCR4基因和蛋白表達的作用[3]。能夠通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制炎癥反應，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成[4]。

本實驗的創新點在于通過觀察黃芪甲苷對miR-33a和ABCA1信號表達的調控，促進巨噬細胞內膽固醇流出的作用，從分子、細胞、組織以及動物水平等多層次揭示黃芪甲苷防治AS的分子機制，為AS相關疾病的防治提供新思路。研究結果顯示：在不影響細胞活性狀況下，黃芪甲苷含藥血清呈時間依賴性下調miR-33a表達；黃芪甲苷含藥血清能明顯上調ABCA1的mRNA和蛋白的表達，但能被轉染miR-33 mimic抑制；黃芪甲苷含藥血清可減少THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞中的脂質蓄積，但能被細胞中轉染miR-33 mimic所弱化；黃芪甲苷減少細胞內膽固醇蓄積與其促進細胞內膽固醇流出有關，細胞中轉入過量miR-33a可以抑制膽固醇流出。病理觀察發現各中藥組血管各層結構正常，排列整齊，局部有小灶性的鈣化顆粒物沉積，病變輕，斑塊小，泡沫細胞和脂質減少，彈力板基本完整，病變程度明顯輕于模型組。與模型組相比，黃芪甲苷組小鼠主動脈的miR-33a表達量降低、ABCA1 mRNA和蛋白相對表達量均升高。以上研究結果表明，黃芪甲苷可通過減少miR-33a的生成，進而上調ABCA1表達，促進巨噬細胞中膽固醇流出，這可能是黃芪甲苷抗動脈粥樣硬化作用的分子機制之一。