肺癌抗原COX-2長肽疫苗的設計及免疫活性檢測*

范雙莉， 任亞麗， 趙志華

(1濟源職業技術學院， 河南 濟源 459000； 2鄭州大學， 河南 鄭州 450000)

肺癌是常見的腫瘤死亡原因之一，盡管最近有系統性的改善治療方案，晚期肺癌患者的預后仍然效果不佳，更有效的治療方式是急需的，免疫治療就是未來治療肺癌的一種途徑[1-2]。已知環加氧酶2(cyclo-oxygenase 2，COX-2)在肺腺癌和非小細胞肺癌中表達明顯上調[3]，COX-2的過度表達在肺癌的發展中起重要作用[4]，COX-2的高水平表達與免疫調節活性有關。COX-2抑制劑可以增加肺癌對放療的敏感性，提高對肺癌的療效[5]。也有實驗通過激動血管緊張素II 1型受體降低COX-2的表達起到治療肺癌的作用。以降低COX-2表達為作用位點的的抗腫瘤藥物可能開辟肺癌治療的新領域。使用軟件預測抗原區域[6]，篩選包含優勢區域的長肽，長肽能被專職抗原提呈細胞樹突狀細胞(dendritic cells, DC)有效加工和提呈，在流通的淋巴結里表位能被持續的提呈[7]，另外長肽在體內降解較慢。為此我們選擇COX-2進行預測并設計長肽，進行免疫學活性實驗，希望能為腫瘤多肽疫苗候選效果更好的長肽。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺腺A549細胞由實驗室常規保存，采用37 ℃、 5% CO2、飽和濕度培養條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養基常規培養。T2A2細胞為轉染HLA-A*0201分子的TAP缺陷T2細胞系，用含10%胎牛血清的IMDM培養基在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)從醫院血站提供的HLA-A2+健康供者血液分離所得。

2 方法

2.1設計長肽疫苗 首先對肺癌抗原COX-2進行HLA-A2限制性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTL)表位肽的預測，使用生物信息學預測軟件NetCTL 1.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)[8]、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)[9]和IEDB(http://tools.iedb.org/main/tcell/)[10]軟件對COX-2氨基酸序列預測打分。CTL表位限制性MHC類型為HLA-A*02。預測抗原肽長度為9個氨基酸。目的抗原COX-2的氨基酸序列參照GenBank: AAA58433.1所提供的序列。根據集中的HLA-A2限制性CTL表位設計COX-2抗原來源的長肽，共獲得3條長肽，分別為COX-2 P315-338、P355-377和P375-401。

2.2HLA-A2限制性CTL表位肽的合成 候選表位肽由上海生工生物工程有限公司合成，經反相高效液相色譜法分析純化后，其純度大于95%，經電噴霧質譜法鑒定相對分子質量符合理論值。

2.3外周血單個核細胞的分離 準備50 mL離心管，預先加肝素鈉，預防血凝。抽取外周血20 mL或40 mL，加入等體積的PBS混勻；將淋巴細胞分離液4 mL加入到15 mL 離心管中，緩慢注入PBS與血液的混合液8 mL；常規聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，2 000 r/min，離心20 min后，用彎管將上層血清抽掉，再輕輕抽取白膜層；按PBS∶白膜層細胞>5∶1的比例，洗滌白膜層，2 000 r/min離心15 min，得白膜層細胞；用含10%胎牛血清的IMDM培養基重懸，計數。

2.4DC的體外誘導 按上述方法分離得到PBMCs，10%胎牛血清IMDM培養基重懸，計數2×109/L，按每孔2 mL分至6孔板中，37 ℃、5%CO2培養箱中培養6 h；將未黏附的細胞洗脫，抽取液體及未貼壁的細胞，1 000 r/min離心10 min，收集細胞，在6孔板里加入溫熱的IMDM培養基2 mL，加入IMDM培養基2 mL，并補加粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF; 100 μg/L)和白細胞介素 4(interleukin-4，IL-4； 50 μg/L)；于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養； 每2 d半量換液1次，并補加GM-CSF(100 μg/L)和IL-4(50 μg/L)；培養至第5天加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS; 100 μg/L)，誘導DC成熟；48 h 后收集細胞[11]。

2.5DC荷肽實驗 收集成熟的DC，用無血清IMDM培養基充分洗滌，重懸計數(0.5～1)×109/L；加入長肽20 mg/L，培養4 h；收集細胞，用無血清IMDM培養基洗滌1次；重懸計數，加入50～100 μg的絲裂霉素C，加入20 mg/L的長肽，培養1 h；用含10%已滅活胎牛血清的IMDM培養基重懸，計數2×108/L；取PBMCs，重懸計數2×109/L，荷肽的DC作為刺激細胞，兩者各取0.5 mL加入24孔板；隔日添加重組白細胞介素2(recombinant interleukin-2, rIL-2; 5×104U/L)，每3 d半量換液，并補加rIL-2； 1 周后收集細胞，以10∶1的比例與新鮮制備的荷肽DC共培養，進行第2輪刺激；第3次刺激后的第3天收集細胞，用于后續活性實驗[12]。

2.6IFN-γ分泌水平的檢測 取出酶聯免疫斑點實驗(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)板條(購自達科為生物技術有限公司)，加200 μL無血清的IMDM培養基進行封閉，靜置10 min；將前期誘導的CTL作為效應細胞，調整細胞濃度為2×109/L，每孔加50 μL;荷肽的DC作為刺激細胞，補加40 μL的無血清IMDM培養基，設立對照孔和實驗孔；37 ℃、5% CO2孵育18 h；傾盡孔中培養基，每孔加入200 μL無菌的去離子水，4 ℃裂解細胞10 min；傾盡孔內液體，加入200 μL 1×Washing Buffer洗滌6次，每次停留60 s；加入 100 μL生物素標記的抗體，37 ℃孵育1 h；傾盡孔內液體，加入200 μL 1×Washing Buf-fer進行洗滌，方法同上，在吸水紙上拍干；加入100 μL酶聯親和素，37 ℃孵育1 h；每孔加入200 μL 1×Washing Buffer進行洗滌，方法同上；加入100 μL現配的AEC顯色液，25 ℃避光靜置30 min；結束后置于通風處，室溫靜置干燥；結果用 ELISPOT 圖像分析儀計數 96 孔板中每孔的斑點數[13]。

2.7羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester，CFSE)熒光染色檢測細胞毒性實驗 通過離心收集靶細胞，并將細胞重懸于含有1%FCS的PBS中，并將細胞濃度調節至1×109/L。致敏靶細胞：每1 mL細胞懸浮液加入0.5 μL 5 mmol/L CFSE(購自Sigma)，室溫、光照孵育4 min。對照靶細胞：每1 mL細胞懸液中加入0.5 μL 100 μmol/L CFSE，室溫、光照孵育4 min。將細胞用5% FCS-PBS洗滌1次，離心并除去上清液，將細胞重懸于無血清IMDM培養基中。將效應細胞(前期誘導的CTL作為效應細胞)在無血清IMDM培養基中洗滌1次，并以(1.25～5)×109/L的濃度重懸于無血清IMDM培養基中。將效應細胞(分別為12.5∶1、25∶1和50∶1)與致敏的靶細胞在離心管中混合，靶細胞數為2×104，最終體積并在37℃溫育4 h孵育后，用含有1%FCS和0.1%疊氮化鈉的PBS(FACS)處理相同的E∶T致敏的靶細胞組和對照靶細胞組，并用FACS洗滌。離心，重懸在含4%多聚甲醛的PBS溶液中，流式細胞術檢測殺傷率。殺傷率(%)=(對照樣品中致敏靶細胞的數量-測試樣品中致敏靶細胞的數量)/對照樣品中致敏靶細胞的數量×100%。

2.8乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)實驗檢測細胞毒性 調整效應細胞濃度 2×109/L；調整靶細胞A549細胞濃度為1×108/L，每孔加50 μL，即為每孔5 000個；按設置的效靶比加入效應細胞及各種對照組，每孔終體積為100 μL； 37 ℃、 5% CO2孵育箱中孵育4 h，孵育結束前45 min，在靶細胞最大釋放組和體積校正組中各加入10 μL裂解液；離心孔板，1 000 r/min離心10 min，轉移上清50 μL至96孔板中；每孔加入50 μL乳酸脫氫酶底物混合液，室溫避光孵育30 min；每孔加入50 μL終止液；在酶標儀上設置490 nm波長測定吸光度(A)值。靶細胞殺傷率(%)=(實驗組A值-效應細胞自發釋放組A值-靶細胞自發釋放組A值)/(靶細胞最大釋放組A值-靶細胞自發釋放組A值)×100%[14]。

2.9胞內因子染色法檢測T細胞釋放IFN-γ水平 誘導的CTL作為效應細胞，荷肽的DC作為刺激細胞；陰性對照孔每孔加入1×109/L的效應細胞，終體積為1 mL；陽性對照孔每孔加入1×109/L的效應細胞和100 μL 植物凝集素(phytohemagglutinin, PHA)再補加900 μL無血清的IMDM培養基培養。加入阻斷劑布雷菲德菌素A(brefeldin A, BFA; 5 mg/L)到培養體系中，充分混勻。于培養箱中37 ℃、5% CO2孵育4 h；孵育結束后， 1 500 r/min 離心5 min，收集細胞，用含2% FBS溶液的PBS將細胞重懸。避光加入細胞表面抗體，4 ℃避光孵育20 min， 1 500 r/min 離心5 min。用細胞染色溶液洗滌2次，收集細胞，每孔加入100 μL破膜劑，4 ℃孵育20 min。收集細胞，加入抗IFN-γ抗體，4 ℃避光孵育30 min；每管加入500 μL細胞染色溶液，重懸，轉移到Falcon 圓底試管中上機檢測。

3 統計學處理

采用SPSS 16.0標準版統計軟件進行數據分析，用GraphPad Prism軟件繪圖。實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析檢驗多組均數之間的差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 COX-2 HLA-A2限制性CTL表位的預測以及長肽的設計結果

預測COX-2蛋白開放閱讀框中潛在的HLA-A2超型限制性CTL表位，依據NetCTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB軟件的結果，選取在各個預測軟件中分值排名靠前的表位肽，當某一肽段SYFPEITHI的打分不太好，而IEDB和NetCTL 1.2打分較好時，我們也將其列入考慮范圍。設計長肽的長度我們盡量選擇包含已經預測的較好的9個氨基酸肽段。所設計的長肽長度大概25個氨基酸左右。具體打分情況以及設計長肽結果見表1。

2 ELISPOT實驗檢測IFN-γ分泌水平結果

志愿者的PBMCs經過GM-CSF和IL-4的誘導及LPS的刺激，成為成熟的DC。荷載長肽的DC刺激PBMCs 3輪后，ELISPOT實驗檢測誘導能分泌IFN-γ的T細胞數量。與PBS組相比，3條長肽在志愿者中均誘導了很多可以分泌IFN-γ的T淋巴細胞(P<0.05)，見圖1。

3 LDH實驗檢測細胞毒性實驗結果

為了進一步驗證3條長肽特異性的CTL對靶細胞是否有殺傷，我們選擇A549細胞作為靶細胞(A549細胞是屬于COX-2+，HLA-0201+)，進行LDH實驗檢測細胞毒性，結果顯示，當效靶比是50∶1時，P315-338、P355-377和P375-401在志愿者中所誘導的CTL對靶細胞A549的殺傷率分別為31.3%、26.6%和36.6%，較PBS組顯著升高(P<0.05),見圖2。

表1 COX-2抗原HLA-A2限制性CTL表位的預測結果

Figure 1.ELISPOT assay was used to measure IFN-γ release by CTLs induced by DC from PBMCs of healthy donors. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs PBS group.

4 CFSE熒光染色檢測細胞毒性的實驗結果

候選肽所誘導產生的CTL，隨著效靶比的提高殺傷效果相應提高。根據LDH實驗檢測細胞毒性實驗結果，我們將效果較好的P315-338和P375-401進一步用于CFSE熒光染色檢測細胞毒性實驗。這2條候選肽誘導得到的CTL在效靶比為50∶1時對靶細胞的殺傷率較陰性對照組(PBS組)和無關肽(HBcAg18-27)組HBC顯著升高(P<0.05),見圖3。

5 胞內因子染色法檢測長肽體外免疫刺激后IFN-γ的分泌水平

從HLA-A2+健康供者得到的PBMCs，經誘導刺激而成為成熟的DC，荷載長肽的DC刺激PBMCs 3輪后，并且體外培養18 d后獲得特異性的CTL，用胞內因子染色法檢測長肽體外免疫刺激后IFN-γ分泌水平。P315-338和P375-401長肽疫苗誘導的CTL可以分泌較多的IFN-γ (P<0.05)，見圖4。

Figure 2.Specific lysis of A549 cells by the synthetic long peptide-induced CTLs. The effector/target (E/T) ratios were 12.5∶1, 25∶1 and 50∶1. The levels of LDH release were detected. CTLs induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg18-27 were used as negative control. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs PBS group.

討 論

肺癌是嚴重威脅人類健康和生命的疾病。因吸煙和環境因素的影響，肺癌的發病率和病死率呈上升趨勢。肺癌發病率逐年上升，全世界每年新確診肺癌患者約160萬，其病死率在惡性腫瘤引起的死亡中居首位。肺癌是發達國家男性癌癥死亡的最常見原因，也是女性的主要原因之一[15]。腫瘤免疫治療是通過增強患者機體抵抗力和對腫瘤的免疫反應以達到遏制腫瘤的治療方法[16],其中以anti-PD1抗體和嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptorT-cell，CAR-T)療法較常見。目前，美國FDA已批準PD-1可用于惡性黑色素瘤和肺鱗癌的臨床治療。免疫治療在惡性腫瘤治療領域有廣闊前景。目前，免疫治療已廣泛應用于肺癌治療[17]。

Figure 3.Specific lysis of target cells by the CTLs generated from the PBMCs of healthy donor. Detection of antigen-specific cytotoxicity by CFSE assay was perdormed. The effector/target (E/T) ratios were 12.5∶1, 25∶1 and 50∶1. CTLs induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg18-27 were used as negative control. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs PBS group.

Figure 4.In long peptide-pulsed DC assay, IFN-γ release was measured by intracellular cytokine staining assay.The long peptide-pulsed DC was used to induce CTLs from the peripheral blood mononuclear cells of HLA-A*02 healthy volunteers. The CTLs were then stained with IFN-γ and CD8 antibodies. The number in the figure represented the percentage of IFN-γ positive cells among CD8+ T cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs PBS group.

隨著多肽疫苗的應用[18-19]，多肽疫苗在原有誘導CTL能力的基礎上也有新的進展。這些進展多表現在增強多肽疫苗抗腫瘤效應的策略方面,如提高CTL表位的免疫原性，與T輔助表位的聯用，增加多肽的長度，克服HLA分子限制性等[20-21]。杜宇琛等[22]研究發現，使用含CpG序列的寡脫氧核糖核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG-ODN)刺激成熟的 DC 與 Lewis 肺癌細胞系(LLC-1)融合的 DC 疫苗，在體內能產生高效、持久的抗肺癌免疫反應，而肺癌細胞系與成熟的 DC共培養卻不能產生有效的免疫應答。有學者用樹突狀細胞與IL-18基因修飾的 NCI-H460肺癌細胞融合體進行抗腫瘤研究，發現融合細胞能有效激活宿主抗腫瘤的免疫反應；小鼠體內實驗表明，融合細胞能有效減慢荷瘤小鼠的腫瘤生長速度。由此表明，DC 融合疫苗接種有望成為疫苗免疫治療的新策略。

本實驗結果可見P315-338和P375-401有很好的分泌IFN-γ的能力及殺傷靶細胞的能力。DC荷肽組實驗，將誘導成熟的DC荷載上長肽可刺激PBMCs。長肽在經過專職抗原提呈細胞加工處理后，其誘導的T細胞分泌IFN-γ的能力會提高[23]。長肽由于它的長度不能直接結合在抗原結合槽上，必須被抗原提呈細胞吞噬、加工。專職抗原提呈細胞對抗原加工處理的效果比較明顯[24]。目前也有一些負載多肽的DC作為疫苗進行研究的，而DC激動劑等方面的試劑作為腫瘤的輔助治療也有應用[25]。依據軟件預測設計的長肽，雖然不是每一條都可以引起較好的免疫反應，但我們仍然篩選出了效果較好的肽，所以長肽可以作為一種很好的多肽疫苗[26]，我們雖然證明長肽最終誘導了很好的特異性的T細胞，但并沒有指出長肽被加工成了哪些肽段，有沒有加工成與MHCⅡ分子結合的CD4+Th表位。這些問題應該是下一步需要我們去研究解決的。