亮藍G減輕急性CO中毒大鼠海馬的損傷*

楊坤麗， 沈 慧， 李 璐， 張利彬， 李秀娟， 魏林郁， 黃亞迪， 趙紅崗， 江林華， 李東亮△

(新鄉醫學院 1三全學院生理學教研室， 2生理與神經生物學教研室， 3第三附屬醫院， 河南 新鄉 453003)

一氧化碳(carbon monoxide，CO)是造成中毒性死亡最常見的有毒氣體，可引起機體多個系統的損傷，其中，缺氧引起的腦損傷是造成患者死亡的主要原因[1-2]。急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning，ACMP)后數小時會引起神經系統出現炎癥反應和腦組織水腫等一系列病理變化，最終導致神經元的凋亡或壞死，其中海馬神經細胞的損傷尤為嚴重，從而引起學習和記憶能力受損[3-5]。目前普遍認為炎癥在CO中毒腦損傷中起著重要作用，抑制炎癥可以促進CO中毒患者神經功能的恢復，提高學習記憶能力，降低死亡率，但其病理機制和分子靶標仍然不十分清晰[6-7]。

嘌呤能P2X7受體(purinergic P2X7receptor，P2X7R)是三磷酸腺苷門控陽離子通道，屬于嘌呤受體P2X家族的一個亞型。P2X7R在病理情況下被過度激活后會引起白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等促炎因子的釋放，引發系列級聯反應，造成細胞不可逆的損傷[8]。近幾年研究表明P2X7R在許多神經性疾病的炎癥發生中有重要作用，包括阿爾茨海默病[9]、脊柱損傷[10]和腦缺血[11]等。在許多誘導神經炎癥的模型動物，用P2X7R拮抗劑能夠減輕炎癥反應，起到神經保護作用[8,12]，但P2X7R在ACMP腦損傷中的作用至今未見文獻報道。

亮藍G(brilliant blue G，BBG)是P2X7R的特異性拮抗劑，近幾年研究已經證明BBG對許多腦部疾病有神經保護作用。BBG的干預可以減輕阿茲海默病[13]、脊柱損傷[10]和腦缺血[11]引起的神經癥狀和病理結果。然而，BBG對ACMP引起腦損傷的影響尚未見報道。本文觀察BBG對ACMP引起的海馬損傷的影響，探討P2X7R在ACMP引起腦損傷中的作用，試圖揭示ACMP的嘌呤受體機制。

材 料 和 方 法

1 動物

8～10周齡健康雄性SD大鼠，體重280～355 g, 購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，所有操作和動物處理嚴格遵循倫理道德的指導原則，動物合格證號為SCXK(京)2016-0011。

2 主要試劑

99.9% CO氣體(新鄉市北普特殊氣體有限公司)； BBG(Sigma)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β和IL-6酶聯免疫吸附測定試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司)；TRIzol 試劑和RT-qPCR試劑盒(Invitrogen)；HE染色試劑盒(索萊寶科技有限公司)。

3 主要方法

3.1動物分組及模型的制備 80只雄性SD大鼠采取隨機抽樣法分為4組：對照(control)組：腹腔注射1 mL的生理鹽水，30 min后注射100 mL/kg的空氣；ACMP組：腹腔注射1 mL的生理鹽水，30 min后注射100 mL/kg的CO氣體；ACMP+BBG組：腹腔注射BBG(30 mg/kg，溶解于雙蒸水中)，30 min后注射100 mL/kg 的CO氣體；BBG組：腹腔注射BBG(30 mg/kg，溶解于雙蒸水中), 30 min 后注射100 mL/kg 空氣。分組處理后120 min眼內眥取血測碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin,HbCO)的濃度，ACMP組和ACMP+BBG組大鼠在注射CO后2 h HbCO濃度均達75.00%±0.05%以上，達到重度中毒的程度，且2組HbCO沒有差異；control組和BBG組HbCO濃度僅為5.00%±0.60%，表明ACMP大鼠造模成功。染毒6 h后計數各組存活率。

3.2海馬組織的提取及保存 第一批動物：染毒6 h后每組存活的動物中各取5只，10%的水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，斷頭取腦，快速分離左右側海馬，左側立即用干濕稱重法測水含量，右側立即置于-80 ℃保存備用。第二批動物于水迷宮試驗結束后，用上述方法分離左右海馬，分別放入不同EP管中，立即置于-80 ℃保存，用于ELISA和RT-qPCR實驗。

3.3RT-qPCR法檢測P2X7R的mRNA表達 取出冷凍的右側海馬組織，冰上溶解，組織總RNA用TRIzol法提取，然后以總RNA為模板反轉錄為cDNA，步驟如下：取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液，加入1 μL Oligo(dT)18，用無核糖核酸酶的去離子水補足至12 μL，于PCR儀上70 ℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻，依次加入4 μL 5×buffer、 2 μL 10 mmol/L dNTPs、 1 μL RNA inhibitor和1 μL 反轉錄酶，用槍抽吸混勻，在PCR儀上42 ℃保溫60 min，結束后80 ℃保溫5 min滅活反轉錄酶。最后進行PCR定量，配制PCR擴增體系：cDNA 12.5 μL,上、下游引物各2 μL，酶和底物等混合物2.5 μL，加無菌去離子水8 μL。反應條件: 95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性10 s, 60 ℃ 退火60 s, 95 ℃延伸15 s，共40個循環。以標準品GAPDH為內參照，建立擴增標準曲線，結果采用2-ΔΔCt(Livak法)法進行分析，引物序列見表1。

3.4ELISA檢測海馬組織炎癥因子的含量 取出冷凍的左側海馬組織快速稱重，低溫下進行勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液作為待測樣品，-80 ℃保存備用。在各孔中加入標準品或稀釋過的待測樣品各100 μL，37 ℃反應 90 min。加生物素標記抗體工作液100 μL，37 ℃反應 60 min。緩沖液洗滌 3 次。加100 μL ABC工作液，37 ℃反應 30 min，緩沖液洗滌 5 次。加入TMB 90 μL，37 ℃ 反應 20～25 min。加入100 μL TMB 終止液，立即在450 nm 處測量吸光度(A)值。

3.5干濕稱重法檢測海馬組織的含水量 6 h后每組取5只大鼠，在10%的水合氯醛(4 mL/kg)麻醉下斷頭取腦，分離左側海馬，立即置于事先稱重過的1.5 mL的EP管中封口，用電光分析天平(分度值0.000 1)稱濕重，放入電熱恒溫干燥箱100 ℃烘烤72 h后稱干重。測定的含水量公式：含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.6Morris 水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力

3.6.1定位航行實驗 Morris水迷宮內徑160 cm，水深22 cm。水池均分為4個象限，分別標記為NW(northwest)、SW(southwest)、SE(southeast)和NE(northeast)。水迷宮平臺位于SE象限中間，直徑9 cm，平臺上面低于水面0.5 cm。池壁周圍懸掛藍色布簾，水池內壁各象限固定不同形狀的參照物。實驗開始前調整水溫至22 ℃。各組大鼠在未作任何處理的情況下先行定位航行訓練7天，每天提前 30 min 帶入水迷宮實驗室以熟悉環境。每日每只大鼠在每個象限訓練 1 次，訓練時間間隔為25 min。每次訓練的最大時長為 60 s， 60 s 內找不到水下平臺的，將其引至平臺上并停留 30 s，逃避潛伏期記為 60 s，低于 60 s找到平臺的則以實際時間記錄逃避潛伏期。第8天按分組條件給大鼠相應處理， 6 h后每組取5只大鼠在目標象限對側(NW象限)進行定位航行試驗，記錄逃避潛伏期。

3.6.2空間探索實驗 第8天進行，移除水下平臺，水溫保持 22 ℃。將大鼠在NW象限(即目標象限的對側)放入池中，用攝像記錄游泳軌跡，用軟件EthoVision XT 8 (Noldus)進行信號的采集與分析。 記錄時長300 s，觀察在各象限的游泳路徑及時長，分析其空間記憶能力。

3.7HE染色 3 d后每組取5只大鼠，10 %的水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，仰臥固定, 經左心室灌注生理鹽水,看到剪破的右心耳流出清亮液體,然后再灌注4 %的多聚甲醛約250 mL。固定完畢后,迅速斷頭取腦,將腦組織置于4 %多聚甲醛中4 ℃過夜。多聚甲醛浸置后的腦組織常規脫水、透明、浸蠟、包埋、冠狀位切片,每張切片厚約7 μm,每組取3張切片置于載玻片上，進行HE染色，顯微鏡下觀察切片并拍照。

4 統計學處理

結果用SPSS 19.0軟件行統計學分析，數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOAN)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組P2X7R的mRNA表達

RT-qPCR結果顯示，ACMP組海馬組織的P2X7R的mRNA表達量比control組明顯增高(P<0.05), ACMP+BBG組P2X7R的mRNA表達量比ACMP組明顯降低(P<0.05)，BBG組與control組比較差異沒有統計學顯著性，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of P2X7R in the rat hippocampal tissues was measured by RT-qPCR at 6 h after ACMP. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs ACMP group.

2 BBG對ACMP引起的大鼠死亡率的影響

Control組和BBG組存活率都是100%，而ACMP組的存活率為55%，明顯低于control組(P<0.05)； ACMP+BBG組的存活率為75%，較ACMP組有明顯提高(P<0.05)。

3 BBG對ACMP后海馬組織促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6含量的影響

與control組和BBG組相比，ACMP組的IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯升高(P<0.05)；與ACMP組相比，ACMP+BBG組的IL-1β、TNF-α和IL-6含量顯著降低(P<0.05)；control組與BBG組相比的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量的差異沒有統計學顯著性，見圖2。

Figure 2.The effect of BBG on the concentrations of IL-1β, TNF-α and IL-6 in the rat hippocampal tissues at 6 h after ACMP. Mean±SD. n=5. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs ACMP group.

4 BBG對ACMP誘導的海馬組織水腫的影響

Control組和BBG組的海馬組織含水量分別為79.22%±0.82%和78.97%±0.71%，兩者之間的差異無統計學顯著性。ACMP組海馬組織的含水量為80.72%±0.93%，明顯高于control組(P<0.05)；而ACMP+BBG組海馬組織的含水量為79.56%±0.63%，顯著低于ACMP組(P<0.05),見圖3。

Figure 3.The effect of BBG on the water content in rat hip-pocampal tissues at 6 h after ACMP. Mean±SD. n=5. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs ACMP group.

5 BBG對ACMP大鼠學習記憶功能的影響

5.1定位航行訓練的結果 定位航行訓練7 d，結果顯示全部大鼠的逃避潛伏期第1天平均為46.25 s，第7天降至14.02 s，且4組之間的差異均無統計學顯著性，見圖4A。第8天對各組大鼠進行相應藥物處理后發現BBG組與control組相比逃避潛伏期的差異無統計學顯著性，ACMP組的逃避潛伏期較control組顯著延長(P<0.05)，而ACMP+BBG組的逃避潛伏期明顯短于ACMP組(P<0.05)，見圖4B。

5.2空間探索實驗結果 BBG組與control組相比，在目標象限探索時間的差異無統計學顯著性;與control組相比，ACMP組大鼠在目標象限的探索停留時間顯著縮短(P<0.05)，軌跡減少;與ACMP組相比，ACMP+BBG組大鼠在SE象限的探索時間明顯延長(P<0.05)，軌跡增加，見圖5。

6 BBG對ACMP大鼠海馬組織 CA1區細胞形態的影響

HE染色顯示, control組的細胞密集整齊排列，胞體形態規整，胞質豐富，胞核與胞質界限清晰可見；ACMP組海馬CA1區細胞數目減少，細胞排列紊亂，細胞形態不完整, 胞質稀少，胞核與胞質界限模糊，細胞核深染、固縮，呈三角形或不規則形；與ACMP組比較，BBG+ACMP組大鼠海馬 CA1 區神經細胞核固縮現象明顯改善，形態較規則，排列整齊；BBG組與control組無明顯差異，見圖6。這一結果表明，BBG預處理能夠改善急性CO中毒引起的大鼠海馬CA1區神經元損傷。適宜濃度的BBG單獨處理，對大鼠海馬神經元CA1的形態結構無影響。

Figure 4.The result of escape latency of the rat in the Morris water maze. A: the mean latency time to find the platform had no significant difference between the 4 groups from the 1st day to the 7th day; B: the effect of BBG on the escape latency at 6 h after ACMP on the 8th day. Mean±SD. n=5. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs ACMP group.

Figure 5.The effect of BBG on the probe trial at 6 h after ACPM on the 8th day. A: the total time in target quadrant (lower right) in spacial probe phase; B: the typical swimming traces of the 4 groups. Mean±SD. n=5. * P<0.05 vs control group; # P<0.05 vs ACMP group.

討 論

在我國ACMP是急性中毒中最常見的一種，其發病率和死亡率仍然很高。制備ACMP的動物模型對研究ACMP的干預措施有重要意義。傳統的吸入法制備一氧化碳中毒的動物模型分為動態和靜態吸入法，動態吸入法CO需要量大，消耗成本高，操作要求高，對實驗者自身安全也有威脅。靜態吸入法雖操作簡單，但不能排除CO2蓄積、缺氧等干擾因素。模型制備的種種困難制約了對CO中毒的研究進展[14]。1985年Gutierrez等[15]運用腹腔注射CO氣體的方法成功建立了CO中毒動物模型，此方法操作方便，造價低，實驗者安全有保障，并且能夠達到與吸入法相同的CO中毒程度。近年來，隨著對此模型的進一步完善，腹腔注射CO造模的方法得到廣泛應用[16]，本文觀察到腹腔注射CO后 5 min，大鼠出現呼吸急促、煩躁不安等現象，并逐漸加重，30 min左右，大鼠走路不穩、嗜睡、昏睡，2 h 時癥狀更為嚴重，血HbCO濃度超過75%，達重度CO中毒程度。本實驗又一次證明了腹腔注射CO造模，方法簡單，結果可靠，能較好模擬CO中毒的臨床表現，又不構成對實驗者的威脅。

Figure 6.The morphological changes of neural cells in the CA1 region of rat hippocampal tissues were observed by HE staining at 3 d after ACPM (×200).

一氧化碳中毒后缺氧引起的海馬損傷對患者生存率和預后都有極大影響，但其損傷的關鍵環節和受體機制尚不清楚。近幾年研究發現中、重度CO中毒患者腦組織存在過度炎癥反應，看來炎癥可能是CO中毒誘導腦損傷的重要病理進程。文獻報道ACMP后數小時IL-1β和TNF-α等炎癥因子釋放明顯增加，6 h達到高峰，炎癥反應所致損傷達36 h以上[3-5]。過量的IL-1β和TNF-α可能通過誘發和促進炎癥，而后產生免疫損傷、細胞毒性、激活凋亡途徑等一系列反應，引起繼發性神經元損傷[17]。研究證明ACMP患者血IL-2、4、6水平明顯升高，IL-8介導的炎癥反應可能也參與ACMP及遲發型腦病(delayed encephalopathy of acute carbon monoxide， DEACMP)的病理損傷過程，ACMP早期階段中樞神經系統產生IL-6程度與大腦白質脫髓鞘程度有關[18]，但是ACMP后炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6含量增多的機制尚不十分清楚。本研究用ELISA法檢測海馬組織中炎癥因子的含量，發現ACMP后6 h，大鼠海馬組織中IL-1β、TNF-α和IL-6水平明顯增加，這與文獻報道相符[19]。我們用BBG預處理，結果這些促炎細胞因子都明顯降低了，提示P2X7R在ACMP誘導的促炎細胞因子的大量釋放中起著重要作用。

常態下P2X7R只是陽離子通道，參與細胞的正常興奮功能。但在細胞受到損傷時，P2X7R過度激活，就會通過介導一系列的級聯反應，加重細胞損傷。P2X7R與許多神經性疾病的神經炎癥發生相關，目前對于P2X7R研究的熱點是它能夠釋放IL-1β和IL-18等炎癥因子，血液中IL-1β的釋放可以用來作為P2X7R活化的標志。也有報道指出TNF-α、IL-6、CCL2、CCL3 和CXCL2的釋放也能反映P2X7R的激活[20-22]。ACMP引起的IL-1β、TNF-α和IL-6釋放量增多是否也與P2X7R的激活相關呢？目前未見文獻報道，本研究發現ACMP 6 h后P2X7R的mRNA水平明顯增高，提示 ACMP可能誘導P2X7R的表達；采用P2X7R的拮抗劑BBG預處理，可明顯降低ACMP引起的P2X7R mRNA表達的上調，明顯減少了ACMP引起的海馬組織中IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放，并且降低了ACMP大鼠的死亡率，減輕了海馬組織水腫和海馬CA1區神經細胞損傷。上述結果表明P2X7R在ACMP引起腦損傷中起著重要作用，我們的結果也初步說明ACMP可過度刺激P2X7R，引發促炎細胞因子釋放，但ACMP時P2X7R誘導促炎因子釋放的胞內信號通路尚需深入研究。大量促炎因子進一步助推炎癥和水腫反應，導致大量腦細胞死亡。BBG的使用阻斷了P2X7R，也就抑制了ACMP病理進程中炎癥這一關鍵環節，通過抗炎作用改善ACMP引起的海馬損傷。

大腦邊緣系統中的海馬是學習、記憶等高級神經活動的重要部位。當腦組織受到缺氧、 缺血刺激時，IL-1β異常升高，高濃度IL-1β可抑制海馬神經元的興奮性和突觸功能從而導致認知功能受損[23]。McAfoose等[24]認為高濃度IL-1β可直接影響長時程增強的發生，引起學習記憶缺陷。本研究發現ACMP 6 h后，促炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6明顯增高的同時，大鼠學習記憶能力也顯著下降，表明炎癥反應增強與學習記憶能力減退密切相關。近年來有研究表明創傷性腦損傷[25]和帕金森病[26]等神經系統疾病引起的學習記憶能力減退與P2X7R的過度激活有關，使用P2X7R抑制劑能夠改善這些疾病的學習記憶功能減退。然而P2X7R是否參與了大鼠CO中毒后大腦學習記憶損傷的病理過程，至今未見文獻涉及。本文用P2X7R的拮抗劑BBG預處理來研究對ACMP的影響，結果發現ACMP引起的炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放減少了，同時明顯改善了ACMP大鼠的學習記憶功能。提示P2X7R在ACMP引起的海馬學習記憶功能受損中扮演著重要角色，BBG可能是通過抗炎作用來改善ACMP大鼠海馬組織損傷，提高學習記憶能力。本文的這一結果為CO中毒病理機制的研究提供了新思路，為干預CO中毒病理進程提供了新靶點，為開發ACMP腦保護藥物提供了的實驗依據。ACMP后有10%～30%的病人會發生遲發型腦病，再次出現以急性癡呆為主的神經精神癥狀[27]，病人的認知能力嚴重受損，嚴重影響到患者及家庭的生活質量。P2X7R是否在DEACMP中發揮著重要作用、阻斷P2X7R是否可以改善DEACMP的學習記憶功能受損，將是我們課題組下一步希望解決的問題。