RTN1A通過ERK信號誘導腎小管上皮細胞分泌VEGF和IL-8并促進糖尿病腎病腎纖維化*

趙力敏， 楊淑芬， 陳鵬飛， 程文德， 馬云暉

(深圳市龍華區中心醫院 1全科醫學科， 2中心實驗室， 廣東 深圳 518110； 3新疆維吾爾自治區人民醫院腎病科， 新疆 烏魯木齊 830000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常見的難治性并發癥之一，其早期病理通常表現為腎小球肥大，腎小球和腎小管基底膜增厚及系膜區細胞外基質產生增多，慢性發展為腎小球硬化和腎小管間質纖維化，最終導致腎衰竭[1-2]。因此，迫切需要確定DN進展的關鍵介質，以開發有效延緩或阻斷腎小球及其間質纖維化的治療手段來遏制DN進展。網狀蛋白1A(reticulon 1A, RTN1A)由RTN1A基因編碼，定位于內質網，能夠參與調控細胞的內吞作用、細胞凋亡、內質網應激和DNA損傷誘導的細胞死亡[3-4]。RTN1A在人類和小鼠腎臟疾病模型中均高度表達，并且其高表達可導致腎小管細胞內質網應激反應和腎細胞凋亡[5]，而在體外實驗中抑制RTN1A表達可減輕腎小管細胞氧化應激和纖維化反應[6]，說明RTN1A高表達與DN進展和腎損傷嚴重程度相關。最近研究表明，在DN中RTN1A能夠介導內質網應激誘導足細胞損傷[7]。然而，RTN1A在DN中的作用機制及對DN炎癥反應和纖維化影響尚未完全闡明。本研究報道了RTN1A可能通過細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號誘導腎臟分泌炎癥因子和腎纖維化，在HK-2細胞中沉默RTN1A能夠減少細胞因子分泌及纖維化標志物蛋白表達，表明RTN1A可能是治療DN的潛在靶標。

材 料 和 方 法

1 材料

C57BL/6雄性小鼠，6周齡，體重20～25 g, 購自上海斯萊克動物公司，合格證號為SCXK(滬) 2007-0005。人腎小管上皮細胞株HK-2購自上海研晶商貿有限公司。鏈脲佐菌素購自Sigma；Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen；RPMI-1640培養基、胎牛血清和Opti-MEM購自Gibco；RTN1A小干擾RNA (RTN1Asmall interfering RNA,RTN1AsiRNA, siRTN1A)和陰性對照scrambled siRNA購自廣東銳博生物有限公司；抗RTN1A、ERK、p-ERK、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、纖維連接蛋白(fibronectin，FN)和GAPDH抗體購自Abcam；IL-8及測定IL-8和VEGF的ELISA試劑盒購自R&D Systems；PD98059購自MCE。三諾安穩血糖儀購自長沙三諾生物傳感技術股份有限公司。

2 實驗方法

2.1DN模型的復制和動物分組 取12只C57BL/6小鼠隨機分為模型組(DN組)和正常對照組(control組)，每組各6只，禁食12 h后稱體重并測量空腹血糖值。DN組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素， 每只70 mg/kg，每隔1 d注射1次，總共注射3次; control組則注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。小鼠置于同一動物房中，給予標準飲食，連續3 d 隨機測量血糖，DN組小鼠血糖值均≥16.67 mmol/L則糖尿病造模成功，約需10 d 左右。糖尿病小鼠造模成功后，繼續喂養3個月，期間每2周測1次血糖和1次 24 h尿量，每周稱1次體重。3個月后DN模型小鼠可用于實驗。

2.2標本的收集及指標測定 將造模成功的小鼠進行稱重及收集血、尿標本，后解剖收集小鼠腎臟，并稱量各個小鼠的腎臟重量。用腎臟重量(kindey weight，KW)除以小鼠體重(body weight，BW)計算小鼠的腎臟指數(KW/BW)。血標本在早上經小鼠尾靜脈進行采集，隔夜不禁食(禁食12 h)，并用血糖儀測定各組小鼠血糖含量。尿標本在取材前1 d 用小鼠代謝籠進行收集，小鼠在代謝籠中自由飲食飲水，監測24 h尿量。

2.3細胞模型建立 將人腎小管上皮細胞株HK-2用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養基,置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養，待細胞生長至約50%融合度時，隨機分為3組，每組3個重復，用無血清培養基饑餓處理24 h，后每組分別加入含25 mmol/L右旋葡萄糖、5 mmol/L右旋葡萄糖和5 mmol/L右旋葡萄糖+20 mmol/L左旋葡萄糖(levoglucose,LG)的RPMI-1640培養基繼續培養24 h，依次記為高糖(high glucose，HG)組、正常糖(normal glucose，NG)組和NG+LG組。另取適量HK-2細胞分為2組，每組依次加入25 mmol/L右旋葡萄糖+DMSO和25 mmol/L右旋葡萄糖+PD98059(10 μmol/L)處理24 h，分別記為DMSO+HG組和PD98059+HG組，收集各組細胞及其上清液用于Western blot和ELISA檢測。

2.4細胞轉染 取適量對數生長期的HK-2細胞接種至6孔板中，待細胞貼壁過夜長至60%時，按照Lipofectamine 2000轉染試劑操作說明書將scrambled siRNA和siRTN1A轉染至HK-2細胞中，轉染濃度為50 nmol/L，轉染6 h后更換新鮮培養基，并繼續培養至24 h，收集細胞進行Western blot檢測。

2.5VEGF和IL-6分泌檢測 取按方法2.3構建的細胞，用25 mmol/L右旋葡萄糖處理24 h，收集上清液，根據ELISA試劑盒說明書檢測各組細胞VEGF和IL-8的分泌量。

2.6Western blot實驗 分別取造模后糖尿病腎病小鼠和對照組小鼠腎組織，加入適量含0.25%蔗糖的0.01 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，于冰上進行組織研磨，后4 ℃、700×g離心30 min，取上清液用NanoDrop分光光度計測定蛋白質濃度。將處理后的HK-2細胞用PBS洗2次，胰酶消化，離心收集細胞，加入含0.25%蔗糖的0.01 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，冰上裂解后4 ℃、700×g離心30 min，取上清液用NanoDrop分光光度計測定蛋白質濃度。取100～200 μg 蛋白樣品，加入10% SDS-PAGE進行分離蛋白，并將分離后的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，后用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h， I抗4 ℃孵育過夜， II抗室溫孵育2 h，ECL發光液于凝膠成像系統中進行曝光顯影，以GAPDH為內參照， ImageJ軟件分析各組蛋白相對表達水平。

3 統計學處理

采用SPSS 22.0進行統計學分析。實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組數據的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間差異的比較采用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 DN小鼠模型的建立

與control組相比，建立的糖尿病模型小鼠身體消瘦，反應遲鈍，精神萎靡，毛發無光澤，尿量與飲水量均明顯增加，且其血糖較control組明顯升高(P<0.05), 見圖1A；腎組織明顯變肥大，腎臟指數顯著升高(P<0.05), 見圖1B；尿微量白蛋白(urine microalbumin, UMA)和肌酐清除率(creatinine clea-rance, CCr)亦明顯升高(P<0.05), 見圖1C、D。

Figure 1.The changes of blood glucose, kidney index, urine microalbumin (UMA) and creatinine clearance (CCr) in the DN mice after 3 months of modeling. A: the changes of blood glucose levels; B: the changes of kidney index; C: the changes of UMA; D: the changes of CCr. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group.

2 DN模型小鼠腎組織中RTN1A的表達

從DN模型小鼠腎組織樣本中隨機選取了3個樣本，經Western blot檢測發現，與control組相比，DN組RTN1A表達均顯著上調(P<0.05)，提示RTN1A可能與糖尿病腎病發生有關，見圖2。

Figure 2.Western blot analysis of RTN1A protein expression in mouse kidneys. 1, 2 and 3 represent 3 renal tissue samples in each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

3 DN模型小鼠腎臟炎癥因子和纖維化標志物的蛋白水平

經Western blot檢測發現，與control組相比，DN組RTN1A及其下游蛋白p-ERK的水平明顯上調(P<0.05)，而總的ERK蛋白水平無明顯變化;同時細胞因子VEGF和IL-8以及纖維化標志物α-SMA和FN的水平亦顯著上調(P<0.05)，提示DN小鼠模型中發生了腎臟損傷炎癥反應和纖維化，RTN1A可能與此有關，見圖3、表1。

4 RTN1A、細胞因子及纖維化標志物在高糖培養條件下HK-2細胞中蛋白水平的變化

Western blot結果顯示，高糖培養條件下的HK-2細胞中RTN1A及其下游蛋白p-ERK的蛋白水平明顯上調(P<0.05)，而總的ERK蛋白水平無明顯變化;同時纖維化標志物α-SMA和FN的蛋白水平顯著上調(P<0.05)，HK-2細胞炎癥細胞因子VEGF和IL-8分泌顯著增加(P<0.05)，進一步驗證了體內實驗結果，并且說明細胞模型可模擬DN細胞,見圖4、表2。

Figure 3.The images of Western blot for determining the protein levels of ERK signaling proteins, cytokines and fibrosis markers in the mouse kidneys.

表1 小鼠腎臟組織中ERK信號蛋白、細胞因子和纖維化標志物的相對水平

*P<0.05vscontrol group.

5 構建沉默RTN1A的HK-2細胞

Western blot結果顯示， blank組、 scrambled組和siRTN1A組的RTN1A表達量分別為0.76±0.07、 0.74±0.08和 0.25±0.03；轉染siRTN1A的HK-2細胞較scrambled組細胞中RTN1A表達現顯著降低(P<0.05)，表明細胞構建成功，見圖5。

Figure 4.The images of Western blot for determining the protein levels of ERK signaling proteins and fibrosis markers in the HK-2 cells under high glucose (HG) exposure.

表2 高糖培養下HK-2細胞中ERK信號蛋白和纖維化標志物的蛋白水平及細胞因子VEGF和IL-8分泌水平的變化

*P<0.05vsNG group.

Figure 5.The protein expression of RTN1A in the HK-2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs scrambled group.

6 高糖培養條件下沉默RTN1A和ERK抑制劑處理后HK-2細胞中ERK信號蛋白、細胞因子和纖維化標志物的蛋白水平變化

用高糖培養沉默RTN1A和ERK抑制劑處理后的HK-2細胞，Western blot檢測發現RTN1A及下游蛋白p-ERK的水平顯著降低(P<0.05)，總的ERK蛋白水平無明顯變化，同時纖維化標志物α-SMA和FN表達也顯著降低(P<0.05); ELISA檢測發現，HK-2中細胞因子VEGF和IL-8的分泌水平顯著降低(P<0.05)，表明沉默RTN1A表達可通過阻斷ERK信號抑制腎小管上皮細胞分泌細胞因子并抑制其纖維化，見圖6、表3。

討 論

糖尿病腎病是一種致死性糖尿病并發癥，是西方國家終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因[8]。根據美國腎臟數據系統報告，約有43.8%的首次診斷為糖尿病的ESRD患者占DN患病率的36.9%[9], DN已成為最具挑戰性的健康問題之一。盡管近年來針對糖尿病腎病治療手段不斷進步，但仍有近一半的患者不可避免地進展到腎臟疾病的終末期[10]。腎臟纖維化是絕大多數慢性腎臟疾病的終末期共同通路[11]。研究發現，多種因素如高血壓、炎癥、高血糖、高血脂及藥物損傷均可導致腎臟纖維化[11]，但高糖致纖維化的潛在分子機制仍然不清楚，因此，研究腎小管間質纖維化的機制有望為開發有效的DN防治靶點提供依據。

Figure 6.The images of Western blot for determining the protein levels of of ERK signaling proteins and fibrosis markers in the HK-2 cells with RTN1A silencing or ERK inhibitor treatment under high glucose (HG) exposure.

RTN1是內質網相關蛋白，其表達水平與腎損傷的嚴重程度相關，而RTN1A作為RTN1亞型之一，在人類和小鼠腎臟疾病模型中均高度上調，且其高表達可導致ER應激反應和腎細胞凋亡[5]。有研究發現，通過對來自DN患者的轉錄測序發現腎小管間質中RTN1A蛋白表達增加，且其高表達與腎功能降低相關[12]。此外，RTN1A在調節腎小管細胞內質網應激中也起關鍵作用[5]，這些數據強烈支持RTN1A在人類DN進展中的作用。最近研究發現，在腎臟損傷中，RTN1A主要在腎小管間隔中發現高表達，包括腎小管和間質細胞，其在腎小管中高表達表明其可能與腎小管細胞損傷有關，而在間質細胞中RTN1A表達增加，提示其可能在腎臟炎癥中起作用[5]。DN纖維化的病理特征是腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)增厚，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)和膠原蛋白、FN、α-SMA等蛋白質積聚[13-16]。本研究通過腹腔注射鏈脲佐菌素構建了DN小鼠模型，經檢測發現RTN1A在DN腎臟組織中高表達，同時檢測發現纖維化標志物α-SMA和FN表達均顯著增加。成纖維細胞間隔中的纖維化是部分通過激活常駐成纖維細胞而介導的，這些成纖維細胞分泌炎癥因子并進一步刺激近端小管上皮分泌介導局部炎癥和纖維化的促炎細胞因子，此外，趨化細胞因子由成纖維細胞和上皮細胞分泌，并提供指導單核細胞/巨噬細胞和T細胞向腎小管間質中浸潤的方向性梯度[17-19]。炎性浸潤產生另外的纖維化和炎癥介質，其進一步激活成纖維細胞和上皮細胞因子釋放，其中主要會引起VEGF、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)、IL-6、IL-8和血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)表達升高，同時還刺激上皮經歷表型轉變，其中細胞沉積過量的細胞外基質成分[20-23]。有研究表明，白細胞介素17A可誘導人近曲小管上皮分泌IL-6、IL-8、VEGF、粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)等細胞因子發揮促炎和促纖維化作用[17]。本研究發現DN小鼠腎臟組織中細胞因子VEGF和IL-8表達顯著增加，上述結果提示RTN1A可能與腎臟炎癥和纖維化有關。

表3 高糖條件下沉默RTN1A和ERK抑制劑處理后HK-2細胞中ERK信號蛋白、纖維化標記物的蛋白水平及細胞因子VEGF和IL-8的分泌水平的變化

*P<0.05vsscrambled+HG group;#P<0.05vsDMSO+HG group.

為進一步驗證動物實驗中的發現，本研究利用高糖誘導方法建立了DN細胞模型，經Western blot檢測發現HK-2細胞經高糖誘導后RTN1A表達顯著增多，同時細胞因子VEGF和IL-8分泌顯著增加，纖維化標志物α-SMA和FN表達均亦顯著增加，這與體內結果相一致。為證明RTN1A在DN的作用，本研究構建了沉默RTN1A的HK-2細胞，并用高糖進行處理，發現細胞因子VEGF和IL-8分泌以及纖維化標志物α-SMA和FN表達均明顯降低。這些數據表明，RTN1A可能對高血糖引起的腎小管炎癥損傷及纖維化進展有重要作用。

p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)/ERK作為重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白調節激酶，其在糖尿病腎病的發生和發展中也發揮重要作用[24-25]。高糖是引起糖尿病腎病最主要的原因，研究發現在高糖作用下，p38-MAPK/ERK信號通路可被誘導激活[1, 26]，而高葡萄糖條件下激活的ERK將誘導腎臟足細胞中VEGF的mRNA和蛋白表達上調，進而高水平的VEGF導致糖尿病大鼠蛋白尿增加，腎小球滲透率增加并變肥大[8]。此外，活化的p38 MAPK/ERK信號能夠促進ATF2和MEF2C基因的表達，導致腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β以及其它炎癥細胞因子如IL-6和IL-8釋放顯著增加，加速腎小球腎炎的發生，致使更容易發生DN[27-29]，表明p38 MAPK/ERK與DN發生密切相關。最近研究發現，RTN1A能夠通過與p-ERK結合調節介導內質網應激導致腎臟疾病發生[5]。本研究發現，在DN小鼠模型和高糖處理的HK-2細胞中p-ERK均顯著高表達，而沉默RTN1A的HK-2細胞經高糖處理后，p-ERK較對照組顯著降低，結果表明RTN1A可能通過調控p-ERK發揮作用。綜上所述，本研究證實了RTN1A可能通過ERK信號誘導腎臟分泌炎癥因子和纖維化。RTN1A可能是診治DN疾病的潛在靶標。