20-HETE作用受體的發現及其對高血壓的影響*

毛 凌， 賈蟬憶， 賀 滟， 韓 勇

(遵義醫學院基礎醫學院生理教研室， 貴州 遵義 563000)

花生四烯酸(arachidonic acid，AA)可通過環氧合酶和脂氧合酶代謝途徑生成白三烯類、前列腺素類和血栓素類等物質[1]。近年研究發現，AA經過細胞色素P450(cytochrome P450, CYP)代謝途徑中的表氧化酶作用可生成環氧二十碳四烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)，經過羥化酶作用生成羥基二十碳四烯酸(hydroxyeicosatetraeonic acids, HETEs)，如20-羥基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE)。20-HETE作為AA的重要代謝產物，與高血壓、腦卒中、心肌梗死、血管痙攣和血管再狹窄等疾病密切相關[2-4]。近年來研究發現20-HETE的結構類似物可阻斷或模擬20-HETE所誘導的縮血管效應[5]，提示在細胞中存在一種特異性結合位點來調節20-HETE的作用，但由于20-HETE比其它脂類活性物質具有更大的脂溶性特性，會被細胞迅速攝取并由膜磷脂所酯化，因此探究20-HETE是否與細胞膜綁定的G蛋白或其它類型受體結合進而發揮生理作用的研究進展緩慢。

最近，Garcia等[6]學者通過點擊化學交聯、伴侶蛋白分析和受體結合分析等研究方法首次發現，20-HETE可通過G蛋白偶聯受體75(G-protein-coupled receptor 75, GPR75)影響血管功能并引發高血壓。GPR75屬于G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptor,GPCRs)家族中視紫紅質樣受體，被學者列為孤兒GPCRs[7]，并進行了多項研究以確定其配體。在一項研究中發現，在胰島β細胞中表達GPR75并通過CC類趨化因子配體5(C-C motif chemokine ligand 5, CCL5)刺激胰島素合成，但是該研究并未鑒定CCL5和GPR75之間的直接結合或相互作用[8]。20-HETE-GPR75功能聯系的發現，對于揭示20-HETE生物學作用相關分子機制研究具有重要意義。

1 20-HETE作用受體的研究

有學者首先發現20-HETE的一些特異性的結構類似物或拮抗劑可模擬或阻斷其生物作用，提示細胞中存在與20-HETE特異性結合的位點[5]。進一步的研究發現，20-HETE可通過磷脂酶C(phospholipase C, PLC)/蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)途徑依賴機制發揮血管收縮效應及鈉尿排泄作用，由其誘發的細胞遷移和增殖以及內皮功能紊亂和炎癥反應的作用與表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)磷酸化、c-Src和促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信號通路激活密切相關[9]，而EGFR、c-Src和MAPK信號通路是GPCRs的下游作用靶點。此外，有研究發現在腎臟上皮細胞中，20-HETE可通過EGFR和c-Src依賴機制激活Raf/MEK/ERK途徑[10]。這些研究進一步提示細胞內可能存在通過c-Src介導的20-HETE特異性GPCRs-EGFR的轉激活現象，即非配體依賴途徑激活GPCRs。但20-HETE化學性質很不穩定，作為脂質類物質可直接透膜進入細胞，并被迅速酯化為磷脂或與相應膜蛋白結合，從而在細胞內進行分布，這為鑒定20-HETE在細胞內的綁定效應物提出了較高要求。Garcia等[6]應用了具有光敏特性的20-HETE類似物(20-ApheDa)，利用點擊化學方法將20-HETE類似物附著熒光標簽，并使之分布到細胞表面附近，隨后通過被標記的20-HETE類似物，利用蛋白組學等技術鑒定出與之結合的配體，最終發現20-HETE類似物結合的膜蛋白——GPR75蛋白。由于20-HETE在高血壓、腦卒中、心肌梗死、血管壁肥厚、腎缺血/再灌注損傷、血管再生、細胞增殖和腫瘤等疾病的發病機制中起關鍵作用[11]，GPR75的鑒定是深入探究20-HETE在心血管疾病中作用機制的重要發現，為其它脂類活性物質受體的發現提供新方法，為研制治療心血管疾病藥物提供新的靶向目標和新的思路。

2 20-HETE-GPR75與血管內皮細胞功能紊亂

血管內皮功能紊亂是高血壓等心血管疾病、免疫系統疾病、糖尿病以及腫瘤性疾病的誘發因素，內皮功能障礙主要誘因與NO的生物利用度降低密切相關[12-13]。雖然血管內皮細胞不是20-HETE生成的主要部位，但研究表明20-HETE通過與NO的相互作用，在調節血管內皮細胞功能方面發揮重要作用[14],一方面，在NO的非cGMP依賴作用途徑中，NO可與CYP ω-羥化酶家族CYP1B、CYP2C和CYP4A結合，通過減少20-HETE合成，從而降低對大電導鈣激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channel, BKCa)的抑制效應，有效減弱20-HETE介導的血管收縮效應[15];另一方面，20-HETE可通過核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號通路介導，引起內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)解偶聯而阻礙NO生成，導致其生物利用率降低[16]。20-HETE所引起的內皮功能紊亂在高血壓相關的疾病中發揮重要作用，最近一項研究發現，20-HETE通過增強嗜中性粒細胞浸潤作用而誘發內皮功能障礙和凋亡，加重代謝綜合征大鼠的高血壓發展[17]。

Garcia等[6]報道，20-HETE通過降低NO利用率促進血管內皮細胞功能紊亂與GPR75受體的激活密切相關。在該項研究中發現，20-HETE首先與血管內皮細胞膜表面的GPR75綁定，進而激活該受體，活化的GPR75一方面與其綁定單位Gαq/11解離，分離的Gαq/11激活PLC，活化的PLC進而水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, PIP2)生成肌醇三磷酸(inositol trisphosphate, IP3)和二酰甘油(diacylglycerol, DAG)，而IP3具有促使PKC的磷酸化、激活和易位等作用[18];另一方面，GPR75被激活后促進與其結合的GPCR激酶2相互作用蛋白1(GPCR kinase 2-interacting protein 1, GIT1)釋放c-Src，c-Src與EGFR結合并使之磷酸化，后者通過激活NF-κB信號通路最終引發內皮eNOS的解聚、血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)的表達，ACE激活腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system, RAS)導致血管緊張素II(angiotensin II, Ang II)升高，Ang II有促進內皮素生成、刺激超氧負離子生成的功能，進一步干擾NO的生成及生物利用度，達到收縮血管的作用，最終導致血管內皮功能紊亂[19]?？傊?，如上研究表明GPR75-20-HETE是引起血管內皮細胞功能紊亂，進而誘發血管炎癥、損傷以及高血壓等疾病的關鍵環節。20-HETE-GPR75誘發內皮細胞功能紊亂的信號轉導途徑見圖1。

3 20-HETE-GPR75調節血管平滑肌細胞功能

大量研究證實，20-HETE具有強效的收縮血管平滑肌的作用，通過對血管緊張度的調節引起外周血管收縮，從而參與高血壓的發生和發展[4, 11]。目前研究認為其作用機制主要包括：(1)20-HETE通過抑制平滑肌細胞膜上BKCa的開放減少K+外流，細胞膜發生去極化，激活電壓門控L型Ca2+通道，導致細胞內Ca2+濃度升高,觸發興奮-收縮偶聯，使血管平滑肌細胞產生收縮；(2)直接作用于細胞膜L型Ca2+通道增加Ca2+內流，提高細胞內的Ca2+濃度；(3)激活Rho相關激酶(Rho-associated kinase, ROCK)增加平滑肌細胞對Ca2+敏感性。

在培養的大鼠主動脈平滑肌細胞中，Garcia等[6]同樣鑒定出20-HETE與GPR75的綁定，通過GPR75介導20-HETE對血管緊張度的調節作用。20-HETE首先與平滑肌細胞膜表面GPR75結合并使其激活，活化的GPR75與Gαq/11亞單位解離，Gαq/11通過激活PLC生成IP3，IP3通過PKC的磷酸化途徑以及內質網IP3受體通道增加細胞內的Ca2+水平從而引發血管收縮。該研究還發現，GPR75-20-HETE可通過平滑肌細胞中PKCα激活和c-Src釋放機制磷酸化BKCa的β亞單位從而抑制該通道，降低平滑肌細胞膜電位使L型Ca2+通道激活，誘發細胞內Ca2+濃度升高。此外，20-HETE通過GPR75激活細胞內的PKC磷酸化，除引起細胞內Ca2+濃度升高增強平滑肌細胞收縮，還可激活ROCK信號通路，通過ROCK磷酸化增加肌球蛋白輕鏈磷酸化作用，提高平滑肌細胞對Ca2+敏感性，促進平滑肌細胞收縮[20]。20-HETE-GPR75促進平滑肌細胞收縮的信號轉導途徑見圖2。

4 20-HETE對高血壓的影響及GPR75的作用

大量動物及人體研究實驗表明，在不同類型的高血壓中20-HETE的含量發生改變，減少20-HETE生成或阻斷其作用可起到有效降低血壓的作用[4, 11]。如在自發高血壓模型大鼠中，抑制CYP4A、減少20-HETE生成可降低血管炎癥、氧化應激反應以及改善血管的舒縮功能[21]；在高鹽誘導大鼠高血壓中，阻斷20-HETE生成可降低高鹽誘導的血壓升高作用[22]；在過表達人CYP4A11的轉基因小鼠中，腎臟及尿液中20-HETE生成增加，同時伴有血壓升高，而低鹽飲食以及抑制20-HETE合成可有效降低血壓[23]。最近的研究發現，20-HETE水平增高參與了雄激素誘導的高血壓發展，抑制CYP4A2及20-HETE作用可有效降低雄激素誘導的血壓升高，介導絕經后婦女及多囊卵巢綜合征患者高血壓進程，該種類型高血壓也被學者稱為雄激素誘導20-HETE依賴性高血壓[24]。此外，20-HETE與RAS在高血壓發病機制方面存在復雜的交互作用。一方面，RAS中重要組成部分——Ang II可通過血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin II type 1 receptor, AT1)途徑促進20-HETE生成，阻斷20-HETE的合成可抑制Ang II依賴性高血壓的發展[25];而另一方面，深入研究發現20-HETE又是促進內皮細胞ACE表達的誘導劑和轉錄激活因子，通過ACE誘導激活RAS[26]?？傊?，20-HETE除直接作用于血管內皮及平滑肌細胞導致血管功能障礙誘發高血壓，還可參與多種誘發因素以及體內活性物質，如雄激素和Ang II依賴性高血壓的發生、發展。

如前所述，20-HETE通過激活GPR75機制導致血管內皮細胞NO生物利用度降低，誘發內皮功能紊亂；另一方面，20-HETE-GPR75還可通過激活PKC途徑以及抑制BKCa等機制誘導平滑肌細胞內Ca2+水平增高、增加血管緊張度，如上作用是20-HETE參與高血壓發生發展的重要機制。Garcia等[6]在CYP4A12轉基因小鼠誘導的20-HETE依賴性高血壓中研究證實，GPR75激活是20-HETE促高血壓反應的必要條件。該研究中發現，敲除GPR75有效降低了多西環素處理的CYP4A12轉基因小鼠血壓升高效應，同時在敲除GPR75后，血管中20-HETE誘導的ACE表達水平顯著降低，改善血管內皮細胞功能紊亂，并減少血管平滑肌對于腎上腺素的收縮反應，阻斷了20-HETE誘導的腎臟微血管管壁厚度和直徑的增加?？傊?，在20-HETE依賴性高血壓中，20-HETE誘導的平滑肌緊張度增高、血管內皮功能紊亂以及血管重塑等作用，依賴于GPR75的激活，敲除GPR75的表達發揮類似20-HETE抑制劑的同樣作用，提示GPR75可能是治療高血壓的可行靶點，這也是首次發現GPR75在高血壓的發病中發揮作用。

Figure 2.The signaling pathways of 20-HETE-GPR75 pairing-induced contraction of vascular smooth muscle cells (VSMCs). 20-HETE binds to GPR75 and functionally activates the receptor in VSMCs. This leads to elevate cytosolic Ca2+ level via mechanisms that include activation of Ca2+ channel in the membrane, IP3 receptor-gated Ca2+ channel, and inhibition of the BKCa channels though dissociation of the Gαq/11 subunit and release of c-Src from GIT1, as well as maintain the phosphorylated state of myosin light chain which further sensitizes the VSMCs to Ca2+ by Rho-associated kinase, all of which can stimulate VSMC contraction, leading to the development of hypertension. VGCC: voltage-gated calcium channel; BKCa: large-conductance calcium-activated potassium channel; GIT1: GPCR kinase 2-interacting protein 1; HIC-5: hydrogen peroxide-inducible clone 5 protein; PIP2: phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; IP3: inositol trisphosphate; DAG: diacylglycerol; PKC: protein kinase C; ROCK: Rho-associated kinase; MLCK: myosin light chain kinase.

5 問題與展望

在心血管系統中，20-HETE是一種強效的血管收縮劑，其水平的升高會促進高血壓、腦卒中、心肌梗死等心血管疾病的發生及發展[4]。因此，GPR75受體的發現為深入了解20-HETE調控血壓、參與心血管疾病機制提供了新思路，但該發現也為深入研究提出了諸多問題與挑戰。首要問題是確定GPR75是否在20-HETE發揮作用的所有組織中表達并介導其生物學效應？在人體及動物實驗研究中發現，CYP4A在腎臟中的近端小管、髓袢以及腎血管系統中高表達，是合成20-HETE重要部位，通過鈉尿排泄調節參與血壓的調節[27]。然而，Garcia等[6]的研究表明，GPR75的mRNA和蛋白在腎臟中的表達相對較低。因此，很有必要深入研究確定GPR75是否介導了20-HETE在腎臟的鈉尿排泄作用。此外，近年研究發現CYP4A和CYP4F在心臟組織中表達，在心肌缺血再灌注損傷進程中20-HETE含量增高，抑制其合成可改善再灌注后心肌功能恢復和減少梗死面積發生[28-29]。筆者所在實驗室研究發現，20-HETE具有顯著的促進心肌細胞凋亡和肥大的作用[30-32]，可能是20-HETE參與相關缺血性心臟疾病的重要機制。然而，目前仍尚缺乏GPR75在心臟組織中表達以及相關生物學作用的研究報道。

總之，20-HETE在機體內多種組織器官中生成并發揮相應生物學效應，如在腦組織、肺臟、肝臟、心臟、血管平滑肌、中性粒細胞、血小板等[3-4, 9, 11]，而目前為止，針對GPR75在機體內的表達及其功能的研究非常有限，根據Gene Card等數據庫公布，GPR75僅在腦和脊髓中mRNA以高水平表達，視網膜色素上皮細胞以及神經節細胞中可檢測mRNA水平表達，在胰島β細胞中蛋白水平表達[8]。由于GPR75目前仍被列為孤兒受體[7]，其生物學作用一直未被闡明，20-HETE-GPR75配對機制研究的發現，一方面為揭示20-HETE生物學作用的分子機制提供了新思路，另一方面由于GPR75介導20-HETE血管升壓效應，為進一步探究GPR75功能的研究開辟了重要領域。