虹鱒和硬頭鱒早期幼魚滲透生理及能量平衡的比較研究?

熊瑩槐， 楊靜雯， 董雙林,2??， 王 芳,2， 王 鑫， 周演根

(1．海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003； 2．青島海洋科學與技術國家實驗室,海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266235)

在過去30年中，人們十分關注鮭科魚類對鹽度的適應性，因為這與鮭科(Salmonidae)魚類的發育、品質、移入海水網箱的時間密切相關[1-5]。研究發現，陸封型的種類如溪紅點鮭(Salvelinusfontinalis)、湖紅點鮭(Salvelinusnamaycush)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)等，無需降海即可正常發育[6-9]，而溯河型的種類如大西洋鮭(Salmosalar)、硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)、銀大麻哈魚(Oncorhynchuskisutch)等則需要在淡水中生活一年左右，當達到臨界最小規格后方可入海[10-12]。虹鱒是世界上廣泛養殖的鮭科魚類之一，屬陸封類型, 而硬頭鱒是虹鱒的降海洄游型[8]。有報道稱，虹鱒和硬頭鱒幼魚在海水中比在淡水中長得更快、食物轉化率更高[9, 13]。

由于我國海域夏季水溫較高，目前還鮮有在開放海域成功地規?；B殖虹鱒或硬頭鱒的報道。黃海中部洼地夏季存在一個巨大的冷水團，夏季底層水溫在4.6～9.3 ℃，且水質良好，具有采用相關技術開展規?；B殖鮭科魚類的天然條件[14-15]。虹鱒和硬頭鱒適于利用黃海冷水團進行陸海接力養殖，即先在淡水中繁殖，培育成魚種，然后在適宜溫度的海水中養成商品魚。從淡水移入海水養殖就涉及到一個鹽度過渡問題，因此，查明特定規格魚類較適生長的鹽度就十分重要。

廣鹽性魚類具有較強的滲透壓調控能力來適應鹽度的變化，在高滲環境中廣鹽性魚類主要通過吞飲海水來補充體表丟失的水分，鰓上皮細胞基底膜上的Na+-K+-ATP酶(NKA)和Ca2+-Mg2+-ATP酶(CMA)活性來調節Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Cl-的平衡以適應外界鹽度的變化[16-21]。NKA和CMA不僅能轉運特定的離子，還能為整個離子轉運機制提供動力，因此其活力的變化可能引起滲透壓調節能量消耗的改變，并最終導致魚類能量代謝和分配的變化[22-24]。大量研究表明，一些低代謝率的種類，如虹鱒、鯰(Silurusasotus)、鳉(Oryziaslatipes)用于滲透壓調節的能量占代謝產出的20%～50%[25-30]，而金槍魚(Thunnusthynnus)用于滲透調節的能量占代謝產出的比例高達54%～68%[31]。能量是細胞中各項理化活動正常進行的基礎[32]，其在魚體內儲備的變化和平衡，能夠詮釋魚類對不同環境條件的響應。因此，當魚體滲透壓調節所需要的能量較少時，更多的能量就可用于改善生長[17]。

淡水起源的虹鱒和硬頭鱒需要在淡水中孵化，但在孵化后不久其是否就具有了適應一定鹽度的能力呢？為了了解虹鱒和硬頭鱒早期幼魚耐鹽能力及其差異，本文比較了鹽度對起始體重為3.6 g左右虹鱒和硬頭鱒的血清滲透壓、離子濃度、鰓NKA、CMA及腺苷酸的影響，探討了其耐鹽的滲透壓生理學及能量平衡機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用虹鱒和硬頭鱒均采自日照市萬澤豐鮭鱒魚繁育基地，孵化自丹麥進口的三倍體受精卵。實驗虹鱒和硬頭鱒初始質量分別為(3.55±0.03)和(3.57±0.07)g，體長分別為(6.87±0.38)和(6.87±0.35)cm。將實驗魚在淡水中暫養2周(除鹽度外，其他暫養條件均與實驗條件相同)。每天在8:00和16:00各投喂人工配合飼料1次(能量(19.02±0.17)kJ·g-1, 蛋白質(48.86±1.64)%,脂肪(13.15±3.99)%, 灰分(8.29±0.13)%, 水分(4.34±0.16)%)。

1.2 實驗方法

暫養結束后，分別隨機挑選相同規格活潑健壯的實驗魚開展實驗。設置了0、5、10、15、20、25和30共7個鹽度處理組，分別以S0、S5、S10、S15、S20、S25和S30表示。每個鹽度處理分別設置3個重復，每個重復放養8尾魚。

養魚容器為方形玻璃水族箱(長L=0.55 m，寬W=0.29 m,高H=0.36 m)，實際用水量為50 L。不同鹽度的實驗用水由經過沉淀的自然海水(鹽度為30)和淡水(鹽度為0)調配而成。以每天升高鹽度1～2的速率，分別馴化至 5、10、15、20、25和 30，至目標鹽度后，穩定1周后進行相關實驗。

實驗期間，每天在8:00和16:00各投喂人工配合飼料1次。每天換水1次，每次換水100%。實驗期間溫度為(16.0±0.5)℃，光照周期L∶D=12∶12。為保證水體中充足的溶氧，每個水族箱用氣泵24 h充氣。實驗持續40天。

1.3 樣品的采集、處理及測定

實驗結束時，停食24 h，使用麻醉劑MS-222對魚進行麻醉。麻醉后先尾靜脈采血，然后解剖進行鰓和肌肉組織的取樣。血液在4 ℃冰箱放置3 h，自然分層后4 000 r/min離心10 min，之后抽取上層血清，用于血清滲透壓及Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-離子濃度測定。鰓和肌肉組織經液氮迅速冷凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于鰓絲NKA、CMA酶活力及鰓、肌肉組織腺苷酸的測定。

血清滲透壓采用露點滲透壓儀(Vapro-5520，美國)進行測定，用質量滲透濃度來表示，定義為1 kg溶劑中1 mmol溶質為一個滲透壓單位(mOsm/kg)。血清離子采用羅氏全自動生化分析儀(MODULAR P-800，瑞士)測定。

鰓NKA和CMA酶活力采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行檢測，用定磷法測定酶活性，具體的測定方法參照說明書進行。定義每小時每毫克蛋白的組織中ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量為一個酶活力單位，單位為μ mol Pi(mg prot·h)。

腺苷酸含量采用Agilent 1100高效液相色譜儀(HPLC, Agilent Corp., USA)進行測定。適量冷凍肌肉和鰓組織樣品于液氮環境中磨碎呈粉狀后，取一定量粉樣，加入9倍體積的冰冷高氯酸(0.9 mol·L-1)溶液進行勻漿。勻漿液于7 000g、4 ℃下離心5 min，收集上清液并以3.75 mol·L-1K2CO3中和至pH=6.5～7.0。中和后的溶液于7 000g、4 ℃下離心10 min，收集上清液用于測定相應組織中腺苷酸含量。組織樣品經0.45 μm微孔濾膜過濾后用于測定腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)和腺苷一磷酸(AMP)含量。以UltimateTMAQ-C18柱(4.6 mm×250 mm)，柱溫35 ℃，洗脫時間24 min，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為254 nm。以磷酸緩沖液(40 mmoL·L-1KH2PO4和60 mmol·L-1K2HPO4，pH=6.50)作為流動相。根據測得的峰面積和標準曲線計算腺苷酸含量(微摩爾每克組織，μmol·gww-1)。標準曲線由已知濃度的ATP(0～0.8 mmol·L-1)、ADP(0～1.2 mmol·L-1)和AMP(0～1.5 mmol·L-1)溶液制作而成?；貧w曲線方程、總腺苷酸(TAN)含量計算公式如下所示。

ATP：Y= 15.704X+ 10.473，R2= 1.000；

ADP：Y= 18.25X-27.503，R2= 0.999 9；

AMP：Y= 18.502X-31.28，R2= 0.999 9；

TAN = [ATP] + [ADP] + [AMP]。

式中：Y表示腺苷酸峰面積，X表示腺苷酸濃度，[ATP]、[ADP]和[AMP]分別表示ATP、ADP和AMP濃度。

1.4 數據統計

數據的統計分析皆以SPSS21.0軟件進行。所得數據用雙因素方差(ANOVA)及Tukey多重比較進行分析處理，以P<0.05作為差異顯著水平。所得數據以平均數±標準差(Mean ±SD)表示，作圖軟件為SigmaPlot 12.5。

2 結果

2.1 不同鹽度下虹鱒和硬頭鱒的血清鱒滲透壓

血清滲透壓受鹽度和魚種類的顯著影響，但它們的交互作用對血清滲透壓影響不顯著(見圖1、表1)。隨鹽度升高虹鱒和硬頭鱒血清滲透壓均升高，在S30組達到最大值，且顯著高于其余各組(P<0.05)。各組虹鱒血清滲透壓均顯著高于硬頭鱒(P<0.05)。

2.2 不同鹽度下虹鱒和硬頭鱒的血清離子含量

血清Na+、K+、Ca2+和Mg2+受鹽度、魚種類及其交互作用的顯著影響(見圖2、表1)。隨鹽度升高虹鱒和硬頭鱒血清中Na+、K+、Ca2+和Mg2+均升高，在S30組達到最大值，且顯著高于其余各組(P<0.05)。除S0和S5組外，各組虹鱒血清Na+均顯著高于硬頭鱒(P<0.05)(見圖2a)。在S15、S20、S25和S30組，虹鱒血清K+均顯著高于硬頭鱒(P<0.05)(見圖2b)。除S0和S5組外，虹鱒血清Ca2+均顯著高于硬頭鱒(P<0.05)(見圖2c)。除S0組外，虹鱒血清Mg2+均顯著高于硬頭鱒(P<0.05)(見圖2d)。

(“*”表示同一鹽度下虹鱒和硬頭鱒之間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示不同鹽度間差異顯著(P<0.05)，下同。Stars (*) denote a significant difference between rainbow and steelhead trout under corresponding salinity (P<0.05). Groups of bars with different lower case letters are significantly different (P<0.05), the same below.)

圖1 不同鹽度下虹鱒和硬頭鱒的血清鱒滲透壓Fig. 1 Serum osmolality of the rainbow and steelhead trout in different salinity treatments

注：NKA表示Na+-K+-ATP酶，CMA表示Ca2+-Mg2+-ATP酶。

Note: NKA denotes the Na+-K+-ATPse，CMA denotes the Ca2+-Mg2+-ATPse.

血清Cl-受鹽度和魚種類的顯著影響，但它們的交互作用對血清滲透壓影響不顯著(見圖3、表1)。虹鱒和硬頭鱒血清中Cl-均隨鹽度升高而升高，在S30組達到最大值，且顯著高于其余各組(P<0.05)。各組虹鱒血清Cl-均顯著高于硬頭鱒(P<0.05)。

2.3 不同鹽度下虹鱒、硬頭鱒鰓組織的Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性

鰓組織的NKA和CMA酶活性受鹽度、魚種類及其交互作用的顯著影響(見圖4、表1)。虹鱒和硬頭鱒分別在S5和S10組鰓組織的NKA和CMA酶活性最低(見圖4)，均顯著低于其余各組(P<0.05)，而S30組顯著高于其它各組(P<0.05)。除S5組，各組虹鱒NKA酶均顯著高于硬頭鱒(P<0.05)(見圖4a)。除S0組，其余各組虹鱒CMA酶活性均顯著高于硬頭鱒(P<0.05)(見圖4b)。

(“”表示同一鹽度下虹鱒和硬頭鱒之間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示虹鱒不同鹽度間差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示硬頭鱒不同鹽度間差異顯著(P<0.05)，下同。Stars () denote a significant difference between rainbow and steelhead trout under corresponding salinity (P<0.05). Different lower case letters represent significant difference among rainbow trout treatments, while different capital letters denote the significant difference among steelhead trout treatments (P< 0.05), the same below.)

圖2 不同鹽度下虹鱒和硬頭鱒的血清Na+、K+、Ca2+和Mg2+含量
Fig.2 Serum Na+, K+, Ca2+and Mg2+contents of rainbow and steelhead trout in different salinity treatments

圖3 不同鹽度下虹鱒和硬頭鱒的血清Cl-含量Fig. 3 Serum Cl-contents of rainbow and steelhead trout in different salinity treatments

2.4 不同鹽度下虹鱒、硬頭鱒肌肉和鰓的腺苷酸含量

圖5為虹鱒和硬頭鱒肌肉中的腺苷酸含量。由圖5可知，魚種類、鹽度及其交互作用均對TAN無顯著影響(見圖5a，表2)。ATP、AMP/ATP和ADP/ATP受鹽度、魚種類及其交互作用的顯著影響(見圖5b、c、d，表2)。虹鱒和硬頭鱒ATP分別在S5和S10組最高(見圖5b)，且顯著高于其余各組(P<0.05)。在S0、S10、S15、S20和S25組，硬頭鱒ATP顯著高于虹鱒(P<0.05)，而在S5組，虹鱒ATP顯著高于硬頭鱒(P<0.05)。

虹鱒和硬頭鱒分別在S5和S10組AMP/ATP和ADP/ATP最低(見圖5c、d)，且顯著低于其余各組(P<0.05)。在S10、S15、S20、S25和S30組，硬頭鱒AMP/ATP顯著低于虹鱒(P<0.05)，而在S5組，虹鱒AMP/ATP顯著低于硬頭鱒(P<0.05)。除S5組，其余各組硬頭鱒ADP/ATP均顯著低于虹鱒(P<0.05)。

圖4 不同鹽度下虹鱒、硬頭鱒鰓組織的Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性Fig.4 Effects of salinity on the activity of Na+-K+-ATP and Ca2+-Mg2+-ATP in gill of rainbow and steelhead trout

(ATP為腺苷三磷酸，ADP為腺苷二磷酸，AMP為腺苷一磷酸，TAN為三者之和，下同。ATP is adenosine triphosphate, ADP is adenosine diphosphate, AMP is adenosine monophosphate, TAN is the sum of the ATP, ADP and AMP, the same below.)

圖5 不同鹽度下虹鱒和硬頭鱒肌肉的腺苷酸含量Fig. 5 Effects of salinity on adenine nucleotides in the muscles of rainbow and steelhead trout

圖6為虹鱒和硬頭鱒在鰓中的腺苷酸含量。由圖6可知，魚種類、鹽度及其交互作用均對TAN無顯著影響(見圖6a、表2)。ATP、AMP/ATP和ADP/ATP受鹽度、魚種類及其交互作用的顯著影響(見圖6b、c、d、表2)。虹鱒和硬頭鱒的ATP分別在S5和S10組最高(見圖6b)，且顯著高于其余各組(P<0.05)。在S5組，硬頭鱒ATP顯著低于虹鱒(P<0.05)，其余各組均顯著高于虹鱒(P<0.05)。

虹鱒和硬頭鱒分別在S5和S10組AMP/ATP和ADP/ATP最低(見圖6c、d)，且顯著低于其余各組(P<0.05)。在S5組，硬頭鱒AMP/ATP和ADP/ATP顯著高于虹鱒(P<0.05)，其余各組均顯著低于虹鱒(P<0.05)。

圖6 不同鹽度下虹鱒和硬頭鱒鰓的腺苷酸含量Fig. 6 Effects of salinity on adenine nucleotides in the gills of rainbow and steelhead trout

3 討論

參與魚類調控血清滲透壓平衡的離子主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Cl-等[33, 34]。在外界鹽度變化時，硬骨魚類血清滲透壓起初會隨之迅速升高或降低，隨后將恢復回初始狀態，整個生理過程受滲透壓調節機制的影響[35]。本研究中，虹鱒和硬頭鱒血清滲透壓及Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Cl-均隨鹽度升高而升高，S25和S30組均顯著高于其余各組。在實驗進行了7天后，S20、S25和S30組的虹鱒各死亡0、1和3尾，而硬頭鱒各死亡0、0和2尾；本實驗結束時，虹鱒在S20、S25和S30組存活率分別為95.83%±7.22%、58.33%±7.23%和37.50%±21.65%，其余各組存活率為100%；硬頭鱒在S20、S25和S30組存活率分別為91.67%±7.22%、87.50%±7.23%和37.50%±21.65%(數據待發表)，可推測虹鱒和硬頭鱒早期幼魚耐鹽上限分別為20和25，高鹽脅迫能造成虹鱒和硬頭鱒血清中離子的濃縮，以致滲透壓長時間處于較高水平。相關研究表明，莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[36]、點籃子魚(Siganusguttatas)[37]、大西洋鱘(Acipenseridae)[38]、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[39]等廣鹽性魚類的血清滲透壓和離子濃度與鹽度成正比。另外，在S15、S20、S25和S30組，硬頭鱒血清滲透壓和離子濃度均顯著低于虹鱒，表明硬頭鱒對離子的外排速度快于虹鱒，因此也更耐鹽。有研究表明，不同魚類滲透壓和離子濃度變化的程度，受種間差異、鹽度變化范圍等的影響[40-41]，一般來說溯河型鮭科魚類滲透調節能力強于陸封型種類[42]。

鰓上皮細胞基底膜上的NKA和CMA是魚類調節滲透平衡的重要酶，其酶活力與血清滲透壓水平的變化緊密相關[16-19]。在本研究中，虹鱒、硬頭鱒鰓組織NKA和CMA酶活性分別在S5和S10組顯著低于其余各組，而均在S30組顯著高于其余各組；在S10、S15、S20、S25和S30組，虹鱒鰓絲NKA和CMA酶活性均顯著高于硬頭鱒。這可能由于在高鹽度組虹鱒和硬頭鱒體內外滲透壓差值較大，血清滲透壓較高，需要通過活性較高的NKA和CMA酶加快外排離子的速度，以維持穩定的滲透壓。相關研究表明，當廣鹽性魚類處于等滲環境下，NKA酶活性呈最低值[43]，此時生長較海水中也更有優勢[44-46]。

在鹽度脅迫時，虹鱒和硬頭鱒會通過機體的滲透壓調控機制，對離子和水分的吸收和分泌，以實現內環境的穩定，這一系列生理活動需要耗費大量的能量[31, 47-48]。本研究發現，虹鱒、硬頭鱒肌肉組織ATP含量分別在S5和S10組顯著高于其余各組，這說明虹鱒、硬頭鱒分別在鹽度5和10能量儲備高，有較多的能量可用于生長。此外，虹鱒、硬頭鱒鰓中的ATP含量均在S30組顯著低于其余各組，而AMP/ATP顯著高于其余各組，表明在S30組虹鱒、硬頭鱒需要更多的能量用于滲透調節。這可能是由于鹽度5和10分別接近虹鱒、硬頭鱒的等滲點。在等滲環境下廣鹽性魚類用于滲透調節的能量消耗最少，此時用于生長的能量比例較低滲和高滲條件下更高，因而更有利于生長[17, 49]。另外，能量的消耗與魚的種類、鹽度、馴化時間和生活習性等密切相關[50]。本研究結果顯示，在S10、S15、S20、S25和S30組，硬頭鱒肌肉和鰓組織AMP/ATP和ADP/ATP均顯著低于虹鱒，這表明，較比虹鱒而言總體上硬頭鱒滲透壓調節等耗能較少，用于生長的能量分配比例會較高。在不同環境條件下，魚體內會形成一系列適應性生理響應，而這些活動均依賴機體產生的能量，因此能量平衡對魚類在不同鹽度條件下的耐受性以及生長水平具有重要影響[51-53]。

4 結論

3.6g左右的虹鱒、硬頭鱒幼魚分別在鹽度5和10用于滲透調節的能量較少，具有較高的能量儲備，因此生長較好。結合滲透生理及能量平衡結果而言，溯河型硬頭鱒滲透調節能力強于陸封型虹鱒。