草魚魚鱗膠原蛋白肽及其肽-鈣螯合物 的結構表征

張琬悅 王詩瑤 楊平 徐昕 孫子涵

【摘? ?要】 本試驗酶解草魚魚鱗膠原蛋白制備膠原蛋白肽，并以此為原料制備肽-鈣螯合物，利用傅里葉紅外光譜分析法、紫外光譜分析法和差示掃描量熱分析法對所得膠原蛋白肽和肽-鈣螯合物進行結構表征。

【關鍵詞】 草魚魚鱗;膠原蛋白肽;肽-鈣鰲合物;結構表征

Structural characterization of collagen peptide and its peptide-calcium chelate in grass carp scales

Zhang Wanyue? ?Wang Shiyao? ?Yang Ping? ?Xu Xin? ?Sun Zihan

（Grain College Of Shenyang Normal University? ?110000）

[Abstract]? In this experiment， collagen peptide was prepared by enzymatic hydrolysis of grass carp scale collagen protein， and then used as raw material to prepare peptide-calcium chelate. The structure of collagen peptide and peptide-calcium chelate was characterized by Fourier transform infrared spectroscopy， ultraviolet spectroscopy and differential scanning calorimetry.

[Keywords]? grass carp scale; collagen peptide; peptide-calcium chelate; structure characterization

近年來，膠原蛋白肽作為一種新型的功能食品配料在全球范圍內得到廣泛應用。它具有多種生物功效，其中鰲合鈣的作用十分矚目。研究表明，多肽鰲合鈣比氨基酸鰲合鈣更易吸收，是更為理想的促鈣吸收制劑。本試驗采用酶解法，以中性蛋白酶和復合蛋白酶酶解草魚鱗膠原蛋白，利用中空纖維過濾組件過濾酶解液，得到分子量小于10KD的膠原蛋白肽，并以此為原料，制備肽-鈣螯合物。利用傅里葉紅外光譜分析法、紫外光譜分析法及差示熱量掃描法對所得膠原蛋白肽及肽-鈣螯合物的結構進行表征。

1? 材料與方法

1.1? 材料

草魚魚鱗 購于沈陽市小寶生鮮水產店;中性蛋白酶、復合蛋白酶，丹麥Novozymes公司;其余試劑均為國產分析純。

1.2? 主要設備

水浴恒溫振蕩器，北京中西遠大科技有限公司;傅里葉紅外光譜儀，瑞士Bruker公司; BCD-198SIEMENS冰箱，博西華家用電器有限公司;Scientz-12N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司;MicroKros中空纖維過濾組件（10KD），上海瑞普利金生物科技有限公司;差式掃描量熱儀，上海盈諾精密儀器有限公司;紫外分光光度計，濟南思泉醫療機械公司。

1.3? 試驗方法

1.3.1 膠原蛋白肽的制備

1.3.1.1膠原蛋白的制備? 參照文獻[1]的方法，制得草魚魚鱗膠原蛋白。

1.3.1.2膠原蛋白肽的制備? 將膠原蛋白配制成1mg/ml的懸濁液，加入中性蛋白酶及復合蛋白酶，調節PH至6.5，在55℃水浴恒溫振蕩器中酶解223min，反應結束后100℃水浴鍋滅酶10min，得到初步酶解的膠原蛋白肽的溶液。待酶解液冷卻后用中空纖維過濾組件過濾酶解液?；厥找航浾婵绽鋬龈稍锏玫讲蒴~魚鱗膠原蛋白肽樣品。

1.3.2 膠原蛋白肽-鈣螯合物的制備

1.3.2.1 制備? 參照文獻[2]的方法，膠原蛋白肽溶液→調節螯合條件（溫度42℃、p H6.8、投入氯化鈣質量比2：1、時間50min）→螯合→3 倍無水乙醇沉淀螯合物→離心（8 000 r/min;10 min），收集沉淀→真空冷凍干燥

1.3.2.2 膠原蛋白肽與鈣結合率的測定? 采用EDTA絡合滴定法。結果計算如下：

鰲合率/%=（m-m1）/m

螯合物中鈣的質量分數/%=（m-m1）/（m2+m-m1） ×100%

m：鈣離子總質量/mg

m1：游離鈣離子質量/mg

m2：膠原蛋白肽質量/mg

1.3.3 膠原蛋白肽及其肽-鈣螯合物的結構表征

1.3.3.1 差示掃描量熱分析? 稱取樣品5mg左右，用差示掃描量熱儀進行掃描，溫度范圍50-150℃，加熱速率為10℃/min。

1.3.2.2 傅里葉紅外光譜分析? 將1mg膠原蛋白肽及肽-鈣螯合物樣品分別與溴化鉀粉末混合壓片，在400～4 000 cm-1波數區間掃描，分辨率4cm-1。

1.3.2.3 紫外光譜掃描分析? 分別將膠原蛋白肽及肽鈣螯合物樣品配制成1mg/mL的溶液。取適量該溶液在200-500nm處進行紫外掃描。

1.3.2.4 數據分析? 試驗數據為三組數據平均值，以平均值±標準偏差表示，采用Excel2013和Origin 8.0進行數據處理和分析。

2? 結果討論

2.1? 肽鈣鰲合率測定結果

按照上述方法測定鰲合反應液中的鈣離子質量，由公式計算得膠原蛋白肽與鈣離子鰲合率為50.0%±0.5%。螯合物中鈣離子含量為19.7%±0.5%。

2.2? 差示掃描量熱分析測定結果

劉閃等[5]利用差示掃描量熱法測得膠原蛋白肽的熱變性溫度在78.9℃，肽-鈣螯合物則在112℃出現一個較強吸收峰。用差示掃描量熱法測得膠原蛋白肽及肽-鈣螯合物的DSC曲線如圖1所示。膠原蛋白肽的吸收峰出現在73℃，說明此時膠原蛋白肽發生了熱變性。而肽-鈣螯合物的吸收峰出現在117℃，這可能是因為膠原蛋白肽結合鈣離子后自然結構被改變，產生的新物質結構更穩定。由此可以初步推斷膠原蛋白肽與鈣離子發生了鰲合。

2.3? 紅外光譜分析結果

膠原蛋白肽和肽-鈣螯合物的傅里葉紅外光譜如圖3所示。3400cm-1附近為-COOH中-OH的伸縮振動區域與N-H的伸縮振動區域重疊。膠原蛋白肽在此區域內的吸收峰出現在3346 cm-1處，而肽-鈣螯合物的吸收峰藍移至3421cm-1，波峰變寬，這表明肽中氨基的伸縮振動發生變化。膠原蛋白肽的紅外譜圖中波數位于2983 cm-1、2952 cm-1、2831 cm-1、2740 cm-1和2715 cm-1處的峰消失，此為羥基和醛基的伸縮振動區域，原因可能是螯合反應導致膠原蛋白肽內部結構改變。1633cm-1附近的吸收峰來自酰胺Ⅰ帶的-c=o伸縮振動，肽-鈣螯合物的該峰藍至1650 cm-1。1560cm-1附近是酰胺Ⅱ帶氨基面內變形振動，肽-鈣螯合物的此峰紅移至1558cm-1，表明多肽的羧基和氨基均參與了鈣的配位。1400 cm-1處為羧基的特征吸收峰，肽-鈣螯合物的譜圖中此峰消失，說明羧基可能參與了鰲合反應。1081cm-1處為氨基的吸收峰，多肽與鈣鰲合后該峰紅移至1072 cm-1處，表明多肽鏈中的氨基與鈣離子發生鰲合。

2.4? 紫外吸收掃描結果

膠原蛋白肽與肽-鈣鰲合物的紫外掃描光譜如圖3所示。膠原蛋白肽的吸收峰在波長為200～250范圍內較強，這是膠原蛋白肽的殘基和肽鍵的特征吸收區域。膠原蛋白肽的吸收峰出現在234nm，肽-鈣螯合物的吸收峰值在225nm，吸收峰發生偏移，峰的位置向短波長移動。這是由于膠原蛋白肽與鈣離子鰲合后，物質中原子或者分子相互作用，發生價電子躍遷和能量級變化，最終吸收光的波長發生改變。

3? 結論

酶解草魚魚鱗膠原蛋白所得膠原蛋白肽與鈣離子鰲合，傅里葉紅外光譜分析、紫外光譜分析以及差示掃描量熱分析均可以支撐該結論。差示掃描量熱分析顯示經過鰲合反應后，物質的熱變性由73℃升高到117℃，由此推斷產生了一種穩定性更高的產物。比較膠原蛋白肽和肽-鈣螯合物的紅外光譜圖發現，N-H伸縮振動發生了改變，同時波峰變寬;酰胺Ⅰ帶的-c=o伸縮振動和酰胺Ⅱ帶的氨基面內變形振動發生了變化，同時1081cm-1處吸收峰發生了紅移，即氨基的伸縮振動發生變化。氨基參與了螯合反應。而膠原蛋白肽在1400 cm-1處羧基的特征吸收峰在肽-鈣螯合物的譜圖中消失，說明膠原蛋白肽中的羧基也參與了鰲合反應。紫外光譜分析結果顯示，相比膠原蛋白肽的吸收峰，肽-鈣螯合物的最大吸收峰向短波長處移動，說明物質吸收光的性能改變，即鰲合鈣使物質的結構發生了改變。

綜合以上結果，草魚魚鱗膠原蛋白肽與鈣結合，生成了肽-鈣鰲合物。

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