柴樸湯對哮喘大鼠肺組織MAL/MAPK/ERK通路的影響*

劉鑫，劉穆華，羅淑瑛

[1.南華大學附屬第一醫院（南華大學第一臨床學院） 中醫科，湖南 衡陽 421001；2.湖南省婁底市中心醫院 呼吸內科，湖南 婁底 417000]

哮喘是一種具有多種發病機制的疾病，與過敏有關，是遺傳和環境相互作用的結果，哮喘被定義為氣道慢性炎癥[1]。細胞外調節蛋白激酶（ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的一種，可以在很多細胞中表達，ERK1/2是ERK的一種亞型，已證明主要分布在氣道平滑肌細胞上。研究發現ERK1/2通路參與哮喘氣道慢性炎癥及黏液分泌等過程[2]。而前期研究發現哮喘患者血清能誘導MAL表達下調，而柴樸湯含藥血清能使之表達增加，減輕哮喘的炎癥反應[3-4]。但柴樸湯是否能調控MAPK/ERK通路，減少炎癥因子的分泌，目前尚未有研究報道。因此，本實驗旨在研究柴樸湯是否能通過影響T細胞成熟相關蛋白（MAL）及MAPK/ERK通路的表達來改善哮喘的炎癥反應癥狀，為柴樸湯治療哮喘提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性SD大鼠，體重（220±20）g，40只，購于南華大學動物部。卵蛋白（OVA）（美國Sigma公司），氫氧化鋁干粉（Al（OH）3）（廣州化學試劑廠），中藥配方顆粒（廣東一方制藥有限公司），PD98059（深圳欣博盛生物科技有限公司），兔抗p-ERK多克隆抗體（武漢博士德生物技術公司），MAL抗體（北京博奧森），PCR引物、動物總RNA快速提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（上海碧云天研究所）。JSC-OK超聲波霧化器（遼寧省鞍山儀器廠），封閉霧化箱（自制），低溫超速離心機（德國Eppendorf公司），凝膠成像分析儀（美國Alpha公司），PCR儀（廣州華粵公司）。

1.2 哮喘模型的復制

將40只大鼠按隨機數字表法隨機分為4組：哮喘組、柴樸湯組、柴樸湯+MAPK/ERK通路抑制劑（PD98059）（柴抑組）、對照組，每組10只。適應性喂養1周，按照參考文獻[5]復制哮喘模型。除對照組外，其余各組均予以OVA 1 mg+Al（OH）3100 mg+生理鹽水混合液1 ml于第1和8天腹腔注射致敏。自第15天開始，置于自制的霧化箱中，用霧化器將1% 1 mg+Al（OH）3 100 mg+生理鹽水霧化吸入激發30 min，隔天1次，共8周。以大鼠出現呼吸節律紊亂、耳、尾及口唇紫紺、不喜活動代表模型復制成功。對照組用生理鹽水代替。在哮喘組基礎上，自第15天開始，柴樸湯組每次霧化前30 min予以柴樸湯（1.5 g/kg）2 ml灌胃，柴抑組每次霧化前30 min予以PD98059（3 mg/kg）[6]腹腔注射，同時給予柴樸湯（1.5 g/kg）2 ml灌胃。末次霧化24 h后，予以10%水合氯醛1 ml腹腔注射麻醉，腹主動脈放血處死大鼠，用RT-PCR檢測肺組織中MAL mRNA的表達，免疫組織化學（簡稱免疫組化）檢測MAL、p-ERK1/2蛋白在肺組織中的表達。

柴樸湯由柴胡（產品批號5090141）、半夏（批號 50933781）、黃芩（批號505020T）、茯苓（批號5092201）、厚樸（批號412390T）、大棗（批號 5083021）、甘草（批號5090751）、白參（批號504321T）、蘇葉（批號412149T）、生姜（批號5074131）等中藥配方顆粒組成，由廣東一方制藥有限公司提供，按7∶5∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶2∶1比例配制，1 g顆粒相當于生藥6.8 g。生理鹽水沖泡，現配現用。

1.3 實驗方法

1.3.1 病理學觀察 用4%中性甲醛固定肺組織后，取內中帶的肺組織行常規石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡觀察肺組織的形態。

1.3.2 RT-PCR檢測MAL mRNA的表達 按一步法提取肺組織總RNA，引物的設計與合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。β-actin引物：PCR正向 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，反向 5'-CTC CTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，產物長度500 bp；MAL：正向 5'-AACAAAGTGGGAGATTGAGACCTA-3'，反向5'-GTATGGCTGGATAACCAAAGG-3'，產物長度185 bp?？偡磻w系為20 μl。β-actin反應參數：95℃預變性10 min，94℃變性5 min，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環35次，最終72℃延伸5 min，4℃臨時保存。MAL的反應參數：95℃預變性10 min，94℃變性5 min，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，循環40次，最終72℃延伸5 min，4℃臨時保存。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳，用Image J軟件分析各電泳條帶灰度值，以β-actin作為對照，對各組MAL mRNA進行分析。

1.3.3 免疫組化檢測MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的表達 按照試劑盒說明書操作：脫蠟、增加水分、密封、滴加MAL、p-ERK1/2、IL-4一抗、加二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復染。在光學顯微鏡下觀察，棕黃色顆粒代表陽性，測量陽性顆粒的光密度（optical density, OD），計算其平均值代表MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的表達量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組病理組織學改變

哮喘組大鼠肺組織可見大量炎癥細胞（以嗜酸性粒細胞為主）浸潤，皺襞增多，上皮壞死、脫落，杯狀細胞黏液化生明顯，平滑肌及基底膜增厚，管壁增粗，管腔狹窄。柴樸湯組、柴抑組上述病變較哮喘組均有所減輕。對照組肺組織結構正常，氣道上皮完整，無明顯炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組肺組織病理學改變 （HE×200）

2.2 各組大鼠肺組織中MAL mRNA的表達

實驗結果顯示，β-actin的電泳條帶在500 bp處最亮，各組mRNA條帶亮度大致相當。在185 bp處可見MAL mRNA電泳條帶，哮喘組mRNA條帶最暗，柴樸湯組、柴抑組、對照組依次增亮。見圖2。

哮喘組MAL mRNA的表達最少，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組均高于哮喘組，差異有統計學意義（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組兩組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

圖2 MAL mRNA的電泳圖

表1 各組大鼠肺組織中MAL mRNA的相對灰度值（±s）

表1 各組大鼠肺組織中MAL mRNA的相對灰度值（±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與哮喘組比較，P ＜0.05

組別 n MAL mRNA哮喘組 10 0.30±0.011）柴樸湯組 10 1.00±0.031）2）抑制劑組 10 1.00±0.071）2）對照組 10 1.70±0.13 F值 189.118 P值 0.000

2.3 各組大鼠肺組織中MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的表達

免疫組化結果顯示，4組大鼠均可見MAL蛋白陽性的棕黃色顆粒細胞，哮喘組MAL 蛋白的表達最少，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組均高于哮喘組（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3和表2。

對照組未見明顯p-ERK1/2蛋白陽性棕黃色顆粒，其余各組大鼠均可見p-ERK1/2蛋白陽性棕黃色顆粒，主要位于支氣管上皮細胞、平滑肌細胞。哮喘組p-ERK1/2蛋白表達最多，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組均低于哮喘組（P＜0.05）；柴抑組低于柴樸湯組（P＜0.05）。見圖4和表2。

圖3 各組大鼠MAL蛋白的表達 （免疫組化×200）

圖4 各組大鼠p-ERK1/2蛋白的表達（免疫組化×200）

表2 各組大鼠肺組織中MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的平均光密度值 （±s）

表2 各組大鼠肺組織中MAL、p-ERK1/2、IL-4蛋白的平均光密度值 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與哮喘組比較，P ＜0.05；3）與柴樸湯組比較，P ＜0.05

組別 n MAL p-ERK1/2 IL-4哮喘組 10 0.30±0.031） 0.60±0.031） 1.50±0.041）柴樸湯組 10 0.60±0.051）2） 0.40±0.061）2） 0.60±0.091）2）柴抑組 10 0.70±0.061）2） 0.20±0.012）3） 0.40±0.041）2）3）對照組 10 1.1±0.06 0.1±0.03 0.1±0.02 F值 348.506 112.737 568.622 P值 0.000 0.000 0.000

哮喘組IL-4蛋白表達最多，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；柴樸湯組和柴抑組均低于哮喘組（P＜0.05）；柴抑組低于柴樸湯組（P＜0.05）。見圖5和表2。

圖5 各組大鼠IL-4蛋白的表達 （免疫組化×200）

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性炎癥性肺部疾病，近幾十年來全球發病率一直在上升。目前臨床治療哮喘的主要藥物是糖皮質激素，它主要能降低炎癥細胞的聚集及炎癥介質的表達，但長期使用容易并發感染，甚至誘發激素抵抗。而中藥可以減慢哮喘的加重，使哮喘患者的病情好轉，減少因糖皮質激素的不良反應。中醫認為哮喘主要的發病機制是外因觸發，痰堵氣道，痰氣交阻[7]。柴樸湯由小柴胡湯和半夏厚樸湯組成，有理氣、減輕氣道重構的作用，是針對發病機制治療哮喘的有效方劑。

MAL最初由ALONSO等[8]在T細胞分化晚期發現，是一種高度疏水蛋白，位于細胞外圍，參與上皮細胞的吸收和分泌。研究表明，MAL在多種腫瘤細胞（如乳腺癌、胃癌、宮頸癌及頭頸鱗狀細胞癌）中均有表達，它能穩定上皮細胞的極性，從而抑制腫瘤細胞的發育和轉移[9-10]。MAL還可以通過維持宿主器官的屏障功能而起到保護宿主的作用。屏障主要是指由細胞結合于黏膜上從而形成的緊密連接的線性排列，是具有保護作用的隔離層，屏障功能破壞將導致炎癥及細菌的擴散。而哮喘炎癥反應的源頭是上皮細胞損傷以及修復機制受損[11]，進而上皮細胞的穩定性減弱，屏障功能被破壞。前期已經通過基因研究證實，哮喘大鼠模型中MAL基因的表達下調，且時間越長其表達約低，說明MAL在哮喘的起病及進展中起著重要作用[12]。而柴樸湯通過使MAL的表達上調，進而使哮喘大鼠氣道更加穩定，癥狀隨之減輕[3]。

ERK是一類常見的蛋白激酶，是MAPKs成員之一。ERK包括ERKl和ERK2，活化后的ERK1/2即為p-ERK1/2，其進入細胞核后作用于ATF、AP-1、TNF等炎癥因子，啟動基因的轉錄和翻譯，從而誘導促炎因子與炎癥介質的合成與釋放[13]。研究發現，ERK1/2信號通路參與哮喘的病理發生、發展過程，其可使哮喘的氣道炎癥和氣道重塑過程加重[14]。楊紅菊等[15]使用低氧培養箱培養人氣道上皮細胞復制細胞低氧模型中，發現p-ERK1/2水平增加，黏蛋白MUC5AC過度生成和分泌，提示低氧可以誘導ERK1/2通路的激活，導致氣道黏液高分泌，表明ERK1/2通路涉及氣道炎癥及氣道黏液分泌過程。張元元等[16]實驗表明，IL-33通過ERK1/2信號通路促進哮喘小鼠的氣道重塑，阻斷ERK1/2信號通路，可使哮喘的病變減輕。前期研究已經證實，柴樸湯可以抑制哮喘大鼠肺組織中ERK信號通路的表達，從而減少平滑肌細胞產生纖維連接蛋白，進而抑制哮喘氣道重塑及氣道炎癥的發生、發展[17]。

研究發現，Th1/Th2細胞的失衡與哮喘發病密切相關[18]。而Th2細胞分泌的IL-4，其在哮喘的發病機制中起著重要的作用。IL-4能夠促進Th細胞向Th2分化。它能刺激B細胞活化、增殖，產生抗體，從而參與體液免疫應答，如調控B淋巴細胞，使其產生特異性IgE。IgE能夠結合在嗜酸性粒細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞或血小板的特異性受體上，當同種抗原再次暴露時，抗原與細胞表面特異性IgE交聯，從而導致炎癥釋放的鏈式反應[19]。

本研究結果顯示，哮喘組MAL mRNA和蛋白的表達最低；而在柴樸湯組和柴抑組中MAL mRNA和蛋白的表達均高于哮喘組，且肺組織病變較哮喘組減輕；柴樸湯組和柴抑組比較無差異。哮喘組MAL表達最低，柴樸湯能夠使MAL表達上調，進而減輕哮喘大鼠的炎癥細胞浸潤情況，這與筆者前期研究的結果一致。而MAPK/ERK通路抑制劑PD98059對MAL的表達無抑制作用，說明MAL是ERK通路的上游信號因子。另外，在哮喘組中，p-ERK1/2蛋白的表達高于對照組，提示在哮喘狀態下ERK1/2被磷酸化激活，ERK通路參與了哮喘的起病過程。而p-ERK1/2蛋白的表達在柴樸湯組和柴抑組中均低于哮喘組，說明柴樸湯能抑制ERK1/2的磷酸化，減輕哮喘的氣道炎癥，延緩哮喘的加重。同時，哮喘組大鼠IL-4蛋白表達最高，與對照組比較有差異。而柴樸湯及抑制劑干預后，IL-4表達減少。且柴抑組下降更明顯，提示柴樸湯能夠抑制IL-4的表達，其可能是通過ERK通路實現的。

本研究結果表明，柴樸湯可以上調哮喘大鼠肺組織中MAL的表達，進而抑制MAPK/ERK信號通路，減少IL-4的表達，從而減輕哮喘炎癥反應，這可能是柴樸湯治療哮喘的機制之一。