miRNA-135b對鼻咽癌細胞侵襲和轉移的促進作用

牛善利，滿敏，牛傳貴

（山東省滕州市中心人民醫院 耳鼻喉科，山東 滕州 277500）

鼻咽癌（nasopharvnx cancer, NPC）是一種與EB病毒感染有關，發生于鼻咽腔頂部和側壁的惡性腫瘤。發病以男性居多，男性發病率約是女性發病率的2倍。NPC多在30歲以后開始發病，50～59歲發病人數最多，60歲后趨于平緩[1]。目前研究表明NPC的miRNA是一種非編碼RNA，在自然界廣泛分布，長度一般為22個核苷酸。miRNA對腫瘤的發生發展中發揮著重要作用，關于miRNA-21、miRNA-135b和miRNA-141對癌細胞的作用已有一些報道，張彥兵等在一項肝癌研究中預測發現miRNA-135b的4個靶基因大型腫瘤抑制因子同源蛋白2（large tumor suppressor, homolog 2, LATS2）、轉錄因子β-Trcp（β-transducin repeats containing proteins, β-TrCP）、人源下游調節因子2（N-mycdown-streamregulator 2，NDR2）和亮氨酸拉鏈腫瘤抑制基因（leucine zipper putative tumor suppressor 1, LZTS1），并通過分析發現該基因均以不同的方式參與Hippo信號通路的活性狀態，從而調節相關蛋白的表達[2]，但miRNA-135b對鼻咽癌相關研究的報道較少[3]。MURAKAMI等研究發現，惡性間皮瘤細胞株的LATS2基因表達缺失，由此推斷LATS2編碼的絲氨酸參與腫瘤抑制信號通路，其失活會誘使惡性間皮瘤細胞的增殖[4]。本研究通過檢測miRNA-135b對鼻咽癌CNE1細胞遷移和侵襲能力的影響，研究miRNA-135b的分子機制，為今后鼻咽癌的診治提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養基、0.25%胰蛋白酶（購自美國Thermo Scientific公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（購自北京元亨圣馬生物技術研究所），鼻咽癌CNE1細胞及鼻咽部永生化上皮細胞NP69系（購自南京科佰生物細胞庫），LipofectamineTM2000、Trizol試劑（購自蘇州拜吉氏生物科技有限公司），microRNA逆轉錄試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司），RTPCR試劑盒（購自上海博谷公司），Transwell小室（購自美國Corning公司），基質膠（購自美國BD公司），LATS2 m Ab（購自美國Cell Signaling Technology 公司），ECL發光試劑盒（購自美國Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 采用RPMI 1640培養基培養鼻咽癌CNE1細胞系，培養基加鏈霉素與青霉素，濃度分別為150 u/L及150 mg/L，在37℃、50 ml/L二氧化碳CO2的培養箱靜置培養，每3～4天用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。鼻咽部永生化上皮細胞NP69系接種于含10%胎牛血清的新鮮成分確定的無血清培養基中培養。

1.2.2 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測miRNA-135b的表達 采用RNA提取試劑提取鼻咽癌細胞株及正常鼻咽上皮永生化細胞中總RNA，測定濃度，置入-80℃冰箱冷凍保存。采用SYBR Green法檢測miRNA-135b的相對表達，反應的循環參數：95℃預變性12 min，95℃變性35 s，60℃退火 30 s，70℃延伸35 s，共40個循環，最后71℃延伸9 min。該步驟重復3次。

1.2.3 引物設計及細胞轉染 在網站（http：//www.sanger.ac.uk/soft ware/Rfam/mirna）獲取人miRNA-135b的序列，設計其序列特異性引物，通過NCBI BLAST檢索程序排除其他的同源序列。擴增鼻咽癌CNE1細胞基因組DNA中的miRNA-135b的前體序列。PCR擴增的正、反向引物分別為5'-ATCGCTTGCACTGCAG GGACTGTCG-3'及5'-TCACGTTTCTGGAAACCAGC ACCGC-3'。構建miRNA-135b的干擾載體并提取質粒。轉染前18 h，對擴增的鼻咽癌CNE1采用胰蛋白酶消化處理，調整細胞數為104個/孔。共設3組，試劑對照組、空載體對照組和轉染組。運用LipfectamineTM2000轉染試劑盒進行轉染，轉染后繼續培養48 h，提取RNA，測定濃度，逆轉錄為cDNA。通過RT-PCR檢測miRNA-135b基因的表達，以上的實驗操作重復3次。

1.2.4 Wertern blotting檢測目標LATS2的表達Wertern blotting檢測過表達和干擾miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞及對應對照組細胞中LATS2的表達。過表達miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞和干擾miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞及各對照組細胞經，低溫裂解40 min，高速離心20 min[3]，BCA定量法測定總蛋白濃度，采用110 V電壓進行電泳并恒壓轉移蛋白至PVDF膜，20℃封閉80 min加入小鼠抗人LATS2 mAb（1∶500），4℃過夜，室溫封閉1 h；采用化學發光試劑曝光顯影，超高靈敏度化學發光成像系統成像。對Wertern blotting檢測結果進行半定量分析，LATS2的表達水平標準化后，計算轉染組細胞中該蛋白的表達[5]。

1.2.5 Transwell實驗檢測鼻咽癌CNE1細胞侵襲能力 Transwell基質膠上膠準備完成后，在4℃下放置12 h[6]。采用無血清培養基37℃恒溫水化45 min；比較過表達miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞（過表達組）與空載體細胞（空載體組），及干擾miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞（干擾組）與空載體細胞（對照組）的侵襲能力。對4組細胞進行消化處理，調整細胞懸液濃度為2×105個/ml；下室加入細胞懸液800 μl。37℃、5% CO2培養箱恒溫培養12 h；清理干凈后進行染色，并在200倍顯微鏡下隨機取15個視野計數。

1.2.6 LATS2活性檢測 胰酶消化轉染48 h后，按照20 μl每100萬細胞的比例加入裂解液，采用水浴法裂解細胞，4℃離心機，15 000 r/min離心12 min，取上清液。按照LATS2活性檢測試劑盒的操作說明書檢測實驗組和對照組的LATS2活性變化[7]。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-135b在鼻咽癌CNE1細胞系的表達

CNE1細胞系miRNA-135b相對表達量為（4.85±0.41），而NP69細胞系相對表達量為（1.87±0.15），兩者比較差異有統計學意義（t=5.813，P=0.014），miRNA-135b在鼻咽癌CNE1細胞系中的表達較NP69細胞高。

2.2 miRNA-135b不同表達程度對鼻咽癌CNE1細胞侵襲和轉移的影響

過表達組與空載體組比較，差異有統計學意義（t=6.212，P=0.012），過表達miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞的侵襲和轉移能力有所增加（見圖1A～B）。Transwell實驗結果顯示，干擾組與對照組細胞比較，差異有統計學意義（t=9.330，P=0.001），干擾組鼻咽癌CNE1細胞的侵襲和轉移能力減弱（見圖1C～D）。

2.3 LATS2活性及表達

轉染24 h后LATS2蛋白的活性檢測結果顯示，空載體組與過表達及干擾組比較，差異有統計學意義（t=8.351，P=0.002）；對照組與干擾組比較，差異有統計學意義（t=5.420，P=0.011），LATS2的活性在過表達miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞降低，而在干擾miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞中增強，見圖2。Wertern blotting結果顯示，過表達miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞中LATS2的表達水平有所下降，而干擾該miRNA后的鼻咽癌CNE1細胞中LATS2的表達水平有所增強，見圖3。

圖1 miRNA-135b不同表達程度對鼻咽癌CNE1細胞侵襲和轉移的影響 （×40）

圖2 LATS2的活性

圖3 各組鼻咽癌CNE1細胞中LATS2蛋白的表達水平

3 討論

miRNA是一種可促進癌癥發生或者抑制癌癥發生的基因調節因子，在控制細胞生長、分化及凋亡等生物學過程中發揮著重要的作用[8]，目前已有多種miRNA被發現與癌癥有關，其中miRNA-135b被證明在多種腫瘤細胞中的表達均出現異常。miRNA-135b在結腸癌、肝癌、骨肉瘤等癌癥中均被發現呈高表達狀態[9]。多項研究表明，LATS2為抑癌基因，在腫瘤的發生和調節人類細胞周期中起到關鍵作用。作為LATS家族的新成員，LATS2在多種腫瘤組織中都為表達抑制或基因突變，然而在鼻咽癌組織中卻為過度表達，從而抑制鼻咽癌細胞的生長，誘導其凋亡。ZHANG等[10]在鼻咽癌鼻咽上皮用生化細胞株N96中檢測出LATS2的過度表達，提示LATS2可能在鼻咽癌組織中發揮促進癌細胞生長的作用。

本研究結果顯示，miRNA-135b在鼻咽癌CNE1細胞系中高表達，可能導致鼻咽癌CNE1細胞侵襲和轉移能力增強。Transwell實驗表明，miRNA-135b的過表達提高鼻咽癌CNE1細胞的侵襲和轉移能力，而對miRNA-135b進行干擾后，鼻咽癌CNE1細胞的侵襲和遷移能力下降。與miRNA-135b在其他癌癥的細胞實驗中的結果一致[5]。

有研究表明，miRNA-135b參與腫瘤發生、發展的機制可能與Hippo信號通路，而LATS2基因是Hippo信號通路的相關基因[11-13]，LATS2具有抑癌作用，本研究通過對鼻咽癌CNE1細胞miRNA-135b的過表達和干擾發現，LATS2的活性和表達水平在過表達miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞降低而在干擾miRNA-135b的鼻咽癌CNE1細胞中增強。說明miRNA-135b的表達可能通過影響LATS2活性影響鼻咽癌細胞的生長。

綜上所述，miRNA-135b的過表達可以引起鼻咽癌CNE1細胞的侵襲和轉移能力增強，影響鼻咽癌細胞浸潤擴散，并可通過調節LATS2的活性和表達水平來調控癌變和惡性程度。干擾miRNA-135b可抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲和轉移。miRNA-135b在鼻咽癌的侵襲和轉移中可能起著重要的調節作用，通過調節LATS2或許能夠入核調控鼻咽癌的發生和惡性程度，但詳細的機制有待更進一步的研究。