鱘源致病性魯氏耶爾森菌的分離、鑒定及藥敏研究

楊昆明，張文潤，馬江霞，段成任，郭愛民，謝志勝，岳 城

( 新疆農業大學 動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052 )

全世界現存26種鱘[1]，我國試養的鱘多達十幾種，目前形成規模養殖的種類主要有施氏鱘(Acipenserschrenckii)、西伯利亞鱘(A.baerii)、雜交鱘(Husodauricus♀ ×A.schrenckii♂)和匙吻鱘(Polyodonspathula)，約占鱘養殖總產量的90%以上[2-3]。西伯利亞鱘在20世紀90年代末引入我國，并成功進行了人工繁育。因其具有生長速度快、環境適應能力強、肉厚骨軟、營養豐富、味道鮮美和魚籽品質高等優點，成為我國目前鱘魚養殖的主導品種之一[4]，也是新疆地區現階段主要養殖的鱘魚品種之一。隨著集約化養殖的大力開展，養殖水體污染、餌料污染、漁撈的混用污染等問題接踵而至，高密度的養殖及落后的病害防治技術導致養殖鱘魚暴發性疾病日趨嚴重，給養殖戶造成巨大的經濟損失。

2017年10月，新疆阜康某人工養殖池塘養殖的西伯利亞鱘出現攝食量下降，精神萎靡，泄殖孔紅腫外突等病征，少數魚在下頜、腹部等皮膚處有明顯出血點或斑點。發病水溫20 ℃，日死亡率達15%～20%，給養殖者帶來了巨大的經濟損失。為查明造成西伯利亞鱘死亡的原因，筆者采用臨床剖檢、寄生蟲學、細菌學、病理學等方法進行診斷，在排除寄生蟲感染和病毒感染造成死亡的情況下，懷疑是細菌感染所致。無菌剖檢病鱘內臟，進行細菌分離純化，通過革蘭氏染色、生理生化試驗、分子生物學試驗、藥物敏感性試驗對分離菌進行了初步鑒定，在此基礎上通過測序對細菌的16S rRNA基因序列進行分析并構建進化樹，以探討分離菌在所屬菌群中的分類位置。本研究旨在豐富西伯利亞鱘細菌病病原研究資料，為鱘魚魯氏耶爾森菌病的有效防治提供科學依據，并為新疆地區西伯利亞鱘健康養殖和疾病防控增加新的內容。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

采自新疆阜康某養殖場患病西伯利亞鱘8尾，患病魚泄殖孔紅腫外突，少數魚在下頜、腹部等皮膚處有明顯出血斑或出血點。體質量約180～220 g，用于病理剖檢、病料采集和病原菌分離。剖檢時僅有2尾魚存活，但已側翻，其余6尾全部死亡。試驗用西伯利亞鱘來自該場未發病同批次魚池，體質量約150～200 g，在試驗室暫養3周，確定健康無病后用于回歸感染試驗。

LB瓊脂、M-H培養基、M-H瓊脂培養基(青島日水生物技術有限公司)；細菌微量生化試驗管、革蘭氏染液、藥敏紙片(杭州天河微生物試劑有限公司)；2xEasyTaq SuperMix、膠回收試劑盒以及質粒提取試劑盒(全式金生物科技有限公司)；細菌16S rRNA通用引物序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2 剖檢觀察

肉眼檢查病魚體表有無甲殼類體表寄生蟲，同時分別刮取鰓絲、體表黏液在載玻片上，并在體視顯微鏡下觀察黏液中是否有寄生體表原蟲。依次檢查病魚頭部、體表、腹部、鰭條、肛門等處有無病變；剖開腹部檢查有無腹腔液，肝臟、膽囊、脾臟、腎臟等器官質地、形態及有無出血，腸壁彈性及腸道有無內容物。

1.3 細菌分離培養

用75%酒精噴灑患病鱘魚體表，并用酒精棉球反復擦拭，用滅菌手術剪剖開魚腹部，采集病魚肝臟、脾臟、腸、腎。用接菌環蘸取腹腔液在LB瓊脂培養基上劃線；內臟用無菌PBS液反復沖洗5遍，滅菌手術剪剪開后用橫斷面在LB瓊脂培養基上單向涂抹，再持接菌環在涂抹處劃線，20 ℃倒置培養16～24 h。挑取形態一致的單個優勢菌落進行分離傳代純化培養。

1.4 細菌鑒定

接菌環滅菌挑取瓊脂平板上單個菌落，經稀釋、涂片、固定、染色后，顯微鏡油鏡下觀察菌體形態和顏色，鏡下觀察菌體單一菌落后，在瓊脂平板上挑取單個菌落接種于M-H液體培養基，置于20 ℃恒溫搖床培養24 h，用培養的菌液進行葡萄糖、硫化氫等生理生化試驗，試驗結果參照文獻[11]進行分析。

將經M-H培養基培養的菌液與30%甘油(6∶4)注入到EP管中混勻并用封口膜封口，至-80 ℃冰箱中保存。以菌液為底物，進行菌液PCR擴增。選用細菌通用引物擴增16S rRNA，正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGC-3′，反向引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應體系(25 μL)為：2xEasyTaq SuperMix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，底物2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃再延伸10 min。

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，連接轉化并提取質粒，質粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序結果在美國國立生物技術信息中心網站進行BLAST比對，用Mega 6.0軟件對序列進行多重比較并構建系統發育樹。

1.5 致病菌藥敏試驗

吸取100 μL M-H液體培養基培養的菌液均勻涂布于M-H瓊脂培養基表面，用燒灼后的無菌鑷子夾取藥敏紙片以適當間隔粘貼于瓊脂培養基表面，并輕壓藥敏紙片，使之與培養基充分接觸。正置0.5 h，然后倒置于20 ℃恒溫培養箱培養16～24 h，觀察并測量抑菌圈直徑，根據抑菌圈的大小來判斷該菌對相應藥物的敏感程度[12]。

1.6 回歸感染試驗

試驗設計3個菌液密度組，每個密度組設2個梯密度，高密度組為1×109、1×108cfu/mL，中密度組為1×107、1×106cfu/mL，低密度組為1×105、1×104cfu/mL。測定目標菌液在600 nm下的吸光值(OD600)，用無菌生理鹽水稀釋成相應密度的細菌懸濁液。胸鰭基部注射每尾0.1 mL，對照組注射等量的無菌生理鹽水，每組注射8尾，保持水溫20 ℃，不間斷供氧，連續觀察7 d，每日定時投喂，觀察并記錄試驗魚的癥狀及每日死亡數目，發現死魚及時撈出并剖檢，檢查其體表及內臟器官的病變情況并做記錄，同時進行細菌分離。根據寇氏法計算半數致死密度(LD50)。

2 結果與分析

2.1 體表檢查及病理剖檢結果

患病鱘魚泄殖孔紅腫外突，少數魚在下頜、腹部等皮膚處有明顯出血點或斑點。剖開腹部有少量清亮腹水；體壁及肌肉未出血；肝臟輕微腫大，在肝小葉尖端可見大的出血斑(圖1)；脾臟色深輕微腫大，腎臟正常；腸道內有食物，腸系膜及脂肪有小的出血點；性腺有出血點。

2.2 致病菌形態特征

自患病魚肝臟、性腺、脾臟分離得到一株優勢菌XB2，該菌為革蘭氏陰性菌，短桿菌或球桿菌，菌體兩端鈍圓，成對或單獨存在(圖2)。在LB瓊脂培養基上，菌株XB2可形成邊緣整齊，透明或灰白色，微隆起，表面光滑，直徑1.0～1.5 mm(20 ℃，24 h)的菌落，在血瓊脂平板上未形成溶血圈。

2.3 生理生化結果

生理生化反應顯示菌株XB2產酸不產氣，V-P反應呈陽性，能利用蔗糖、果糖、葡萄糖、明膠、枸櫞酸；在含1%(m/V)氯化鈉中能生長，高于3%(m/V)氯化鈉中不生長；在4 ℃以下、37 ℃以上不生長，20～30 ℃均能正常生長；不利用乳糖、水楊苷、纖維二糖、硫化氫、酒石酸、阿拉伯糖。菌株XB2生理生化特性接近魯氏耶爾森菌標準株(表1)。

2.4 PCR鑒定及系統發育樹構建

對菌株XB2的16S rRNA基因序列進行PCR擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳可見長度約為1500 bp的片段。測序反饋序列上傳美國國立生物技術信息中心進行基因序列比對，結果顯示，菌株XB2與魯氏耶爾森菌相似性最高。將16S rRNA序列在EzBioCloud數據庫上同時進行比對，結果與美國國立生物技術信息中心數據庫比對結果相同，菌株XB2與魯氏耶爾森菌的相似率達99.43%。將序列上傳美國國立生物技術信息中心，獲得序列號為MG581405。選擇15個耶爾森菌屬標準參考株，運用Mega 6.0建立系統發育樹，以豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)為外類群，系統發育樹結果顯示，菌株XB2與湖北株魯氏耶爾森菌KJ812974聚為一支(圖3)。結合生理生化鑒定及基因序列對比分析，確定菌株XB2為魯氏耶爾森菌。

2.5 藥敏試驗結果

用25種水產常用藥進行藥敏試驗，藥敏試驗判定結果參照美國臨床實驗室標準化委員會VET01-A4標準[13]。藥敏結果顯示，魯氏耶爾森菌XB2對氟苯尼考、左氧氟沙星、哌拉西林、阿洛西林等9種藥物敏感；對麥迪霉素、大觀霉素、鏈霉素、氨芐西林等15種藥物呈現不敏感或者耐藥(表2)。

圖1 病理剖檢

圖2 分離菌株XB2革蘭氏染色(油鏡×1000)

測試項目菌株XB2魯氏耶爾森菌標準株[11]測試項目菌株XB2魯氏耶爾森菌標準株[11]V-P反應++蔗糖+-硫化氫--果糖++明膠++1%NaCl++葡萄糖++3%NaCl-+纖維二糖--4%NaCl--西蒙氏枸櫞酸鈉++5%NaCl--酒石酸--4 ℃--乳糖--20 ℃++水楊苷--30 ℃++阿拉伯糖--37 ℃--

注：“+”表示陽性反應，“-”表示陰性反應.

圖3 分離菌株XB2 16S rRNA基因與同源性菌株相應基因構建的系統發育樹

抗生素含藥量μg/片抑菌圈直徑/mmRIS實測抑菌圈直徑mm判定結果慶大霉素10≤1213～14≥1711R左氧氟沙星30≤1314～16≥1722S阿米卡星30≤1415～16≥1713I鏈霉素10≤1112～14≥150R頭孢噻肟30≤1412～22≥2327S頭孢唑肟30≤1415～19≥2028S大觀霉素5≤1415～17≥182R氨曲南30≤1516～21≥2230S多黏菌素B300≤88～11≥1215S哌拉西林100≤1718～20≥2122S麥迪霉素30≤1314～17≥180R氨芐西林10≤1514～16≥170R克拉霉素2≤1314～17≥182R阿奇霉素15≤1314～17≥1814I青霉素G10≤19-≥200R恩諾沙星10≤1213～16≥1713I卡那霉素30≤1314～17≥1814I苯唑西林1≤1011～12≥130R四環素30≤1415～19≥2018I氟苯尼考30≤1213～17≥1828S米諾環素30≤1415～19≥2018I妥布霉素10≤1213～14≥1511R阿洛西林75≤17-≥2020S頭孢他啶30≤1415～17≥1822S

注：R表示低度敏感或不敏感；I表示中度敏感；S表示高度敏感.

2.6 回感試驗結果

健康西伯利亞鱘腹部注射魯氏耶爾森菌XB2后12 h，高密度組和中密度組表現為不攝食、游動緩慢、對外界的刺激不敏感等現象，24 h后高密度組出現死亡，36 h后中密度組出現死亡。對照組全部正常。將死魚及時撈出進行體表檢查，可見生殖孔紅腫外突，剖檢可見，肝臟呈灰白色，上面布滿紅暈，脾臟輕微腫大且顏色深，腸系膜、脂肪以及性腺有小出血點，肌肉未見出血。整體病變與自然發病鱘魚相似，自感染死亡西伯利亞鱘的肝臟、脾臟等組織分離到與魯氏耶爾森菌XB2的形態、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析一致的細菌，表明魯氏耶爾森菌XB2是造成此次西伯利亞鱘患病的病原菌。

表3 人工回感試驗

3 討 論

3.1 西伯利亞鱘細菌病研究進展

目前，國內關于鱘魚細菌性疾病的報道日漸增多，致病菌種類也隨之增加。自患病鱘魚肝臟和心臟分離出兩株停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)[14]，自脾臟、腎臟分離出海豚鏈球菌(S.iniae)[15]，自鱘魚肝臟[16-17]、性腺[18]分離出嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)，自鱘魚體內分離出魯氏耶爾森菌[19]。由此可知，細菌性疾病已使鱘魚的健康養殖受到巨大的威脅，成為其養殖業健康可持續發展的瓶頸之一。

3.2 分離菌鑒定結果及目前細菌鑒定方法的利弊

自發病的西伯利亞鱘的肝臟、脾臟分離得到一株革蘭氏染色陰性短桿菌XB2，由人工感染剖檢可見，發病魚肝臟有點狀出血斑，脾臟表面粗糙，腫大，與自然發病癥狀一致，從肝臟、脾臟分離出與菌株XB2形態、理化性質相一致的菌株，表明該菌株對鱘魚有明顯的致病性。經對菌株XB2的16S rRNA基因進行測序，測序結果進行BLAST對比后構建系統進化樹顯示，菌株XB2與魯氏耶爾森菌湖北株KJ812974聚為一支。

目前細菌的鑒定方法主要包括表型鑒定和分子遺傳學鑒定兩大類。表型鑒定包括細菌形態和生理生化及其蛋白鑒定；分子遺傳學鑒定是在核酸水平上的鑒定[20]。細菌形態鑒定法是經典且常用的分類學方法，操作流程已經程序化，但是鑒定耗時長，而且容易受操作者的操作手法，生化反應本身的不完整性，結果判斷誤差等造成鑒定結果不準確。在本研究中，生理生化反應顯示，菌株XB2產酸不產氣，V-P反應呈陽性，能利用蔗糖、果糖、葡萄糖、明膠、枸櫞酸；而魯氏耶爾森菌標準株不能利用蔗糖和葡萄糖[11]。分子遺傳學鑒定法通過PCR技術將細菌的16S rRNA、ropB、gyrB等基因大量擴增出來，并進行BLAST比對，可靈敏、快速且準確地對細菌的種屬進行鑒定，但是不足之處在于對目標菌樣的純度要求高。綜上所述，如若將表型鑒定和分子遺傳學鑒定同時用在鑒定細菌上，結果愈加真實可靠。本研究通過對菌株XB2的16S rRNA基因序列擴增，并進行同源性分析，構建系統發育樹，結果發現，菌株XB2與魯氏耶爾森菌KJ812974同源性達99.43%，結合革蘭氏染色、生理生化試驗結果，確定菌株XB2為魯氏耶爾森菌。

3.3 魯氏耶爾森菌XB2藥敏結果分析

3.4 魯氏耶爾森菌中草藥的防治

除了通過化學藥品和疫苗防控鱘源魯氏耶爾森菌外，陶健等[24]對魯氏耶爾森菌進行了中草藥試驗，采用試管二倍稀釋法測定了16種中草藥單方及5種復方制劑對魯氏耶爾森菌的最小抑菌質量濃度。結果表明，黃芩和訶子對魯氏耶爾森菌的抑菌作用最強，最小抑菌質量濃度為0.028 g/mL；5種復方制劑中，大黃、黃柏和黃芩3種中草藥以5∶3∶2的比例配伍對魯氏耶爾森菌具有最佳抑菌效果，最小抑菌質量濃度為0.057 g/mL，抑菌效果弱于黃芩，但遠強于大黃單獨使用，為該細菌性疾病的防治提供復方配伍參考。41種中草藥對鱘源魯氏耶爾森菌的藥物敏感性試驗結果表明，烏梅、石榴皮、地榆、杞子對魯氏耶爾森菌有明顯抑菌作用[25]。綜上所述，使用中草藥防控鱘源魯氏耶爾森菌不但操作方便，而且綠色健康，不會造成病原菌產生耐藥性。