高效液相色譜電噴霧電離串聯質譜法測定植物性食品中氟蟲腈及其代謝物的殘留

李敏青,徐 娟,*,王 嵐,安文佳,莊 嘉,孫靈慧

(1.廣東檢驗檢疫技術中心,廣東廣州 510623;2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,廣東廣州 510623)

氟蟲腈是一種苯基吡唑類廣譜殺蟲劑,可用于防治跳蚤、虱子、蟑螂、螨、螞蟻等蟲害,因此在各種農作物生產上得到非常廣泛的應用。但研究表明,該藥具有慢性神經毒性作用,短期攝取大量氟蟲腈會對神經系統造成不良影響,長期攝取可能會損害肝臟、腎臟和甲狀腺[1-2]。在正常使用下,氟蟲腈代謝產物主要有MB 45950(氟蟲腈硫醚)、MB 46136(氟蟲腈砜)、MB 46513(氟甲腈),都具有一定毒性,有的毒性甚至高于母體[3]。國際食品法典(CAC)、中國香港、日本肯定列表中規定,氟蟲腈在糧谷作物或茶葉中的最大殘留限量為0.002 mg/kg;而中國臺灣相關標準規定部分蔬果和谷類的氟蟲腈最大殘留限量為0.001 mg/kg;澳大利亞、美國、歐盟、新西蘭相關標準規定,氟蟲腈(含氟蟲腈硫醚,氟蟲腈砜和氟甲腈)在植物源食品中的最大殘留限量為0.005 mg/kg[4-6]。

目前,氟蟲腈的檢測方法主要有氣相色譜法[7]、氣相色譜-質譜法[8]和液相色譜-串聯質譜法[9-10],而LC/MS-MS兼具靈敏度高、選擇性強的優勢,廣泛應用于農獸藥殘留的檢測?；跇悠坊w復雜多樣,且尚有的文獻中關于植物性食品中氟蟲腈及其代謝物殘留的檢測方法不全面,針對已有報道存在的不足,依據EN15662方法中對于分析農藥殘留的樣本做出的詳細規定,將植物性食品分為含水樣品(含水量≥80%)、含色素樣品、干性樣品(谷物、茶葉)。本文選擇含水樣品(蘋果)、含水量低樣品(香蕉)、含色素樣品(菠菜)、干性樣品(大米、茶葉)、含油脂的干性樣品(大豆)共6種代表性基質,系統優化了QuEChERS方法提取及凈化步驟[11-13]。因此,本文建立了簡單、快速且靈敏度高的檢測方法,能夠及時應對大批量植物性食品中氟蟲腈的檢測任務,滿足目前檢測的實際要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮為色譜純 美國TEDIA公司;無水硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈉(NaCl)、二水合檸檬酸鈉、倍半水合檸檬酸二鈉 分析純,美國Sigma-Aldrich,Missouri;C18、PSA dSPE分散劑 分析純,迪馬科技公司;固相萃取柱GCB/PSA(200 mg/200 mg,3 mL)、Carbon-GCB(250 mg,3 mL) 上海安譜公司;微孔濾膜 0.22 μm,津騰公司;實驗用水為經Milli-Q純水系統制得的超純水(電阻率為18.2 MΩ);氟蟲腈及其代謝物標準物質 純度≥98.0%,Dr.Ehrenstorfer公司;菠菜、蘋果和香蕉等實際樣品 均購于廣州市大型超市。

TSQ Quantiva串聯三重四級桿質譜儀、Ultimate 3000液相色譜儀 美國Thermo Fisher公司;Milli-Q高純水發生器 美國Millipore公司;Sigma-3-18K高速低溫離心機 德國Sigma公司;XP205分析天平(感量0.01 g和0.0001 g) 瑞士Mettler公司;MiltiReax型渦旋振蕩器 德國Heidolph公司;多樣品快速濃縮儀 瑞典BiotageTurboVap?LV;Promax-2020型水平往復振蕩器 德國Heidolph公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取 干性樣品:大米、大豆稱取5.0 g于50 mL離心管,茶葉稱取2.5 g于50 mL離心管,干性樣品預先加10 mL水,渦旋1 min,靜置15 min待充分溶脹后,加入10 mL乙腈,振蕩5 min,加入QuEChERS提取鹽包(CEN EN-15662,內含0.5 g倍半水合檸檬酸二鈉,1 g檸檬酸鈉,1 g氯化鈉,4 g無水硫酸鎂),迅速搖勻,往復水平振蕩10 min,4500 r/min離心5 min,取出待凈化。

果蔬樣品:稱取果蔬樣品10.0 g置于50 mL離心管,加入10 mL乙腈,振蕩5 min,加入QuEChERS提取鹽包(CEN EN-15662)迅速搖勻,往復水平振蕩10 min,4500 r/min離心5 min,取出待凈化。

1.2.2 凈化 蘋果、香蕉、大米:稱取50 mg PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)和150 mg無水硫酸鎂置于高速離心管,吸取待凈化上清液1 mL于其中,充分混合,12000 r/min離心5 min后吸取上清液0.5 mL于小管,加入0.5 mL實驗用水定容至1 mL,渦旋混勻,過濾膜(0.22 μm),裝瓶,供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

大豆、菠菜、茶葉:吸取待凈化上清液1 mL過GCB/PSA固相萃取柱,棄去流出液,再加入2 mL上清液過GCB/PSA固相萃取柱并收集濾液。吸取濾液0.5 mL于小管,加入0.5 mL實驗用水定容至1 mL,渦旋混勻,過濾膜(0.22 μm),裝瓶,供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱:Thermo Accucore aQ(2.6 μm,2.1×150 mm);柱溫:40 ℃;進樣量:2 μL;流速:0.3 mL/min;運行時間:10 min;流動相:A-甲醇、B-水,組成的流動相進行梯度洗脫,洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase composition forlinear gradient elution

1.3.2 質譜條件 電噴霧離子源(ESI);掃描方式:負離子掃描;檢測方式:多反應監測模式(MRM);電噴霧電壓(V):3000;鞘氣(Sheath Gas):40 Arb;輔助氣(Aux Gas):10 Arb;吹掃氣(Sweep Gas):0 Arb;離子源溫度(TEM):350 ℃;傳輸管溫度(TEM):350 ℃。各目標物的保留時間、母離子和子離子、碰撞能量見表2。

表2 各目標化合物的質譜參數Table 2 HPLC-MS/MS parameters for quantitation and confirmation

1.4 提取溶劑的比較

根據氟蟲腈是極性較強的一種物質,按照相似相溶原理,結合樣品基質的特性,本文選取了常用的4種一元溶劑:乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲醇進行比較。按1.2.1節所述方法分別加入4種提取溶劑(所有提取溶劑均為10 mL)進行提取,4500 r/min離心5 min后吸取0.5 mL提取液于小管以吹氮濃縮儀在40 ℃下轉換成乙腈溶劑(少于0.5 mL),加入0.5 mL實驗用水,用乙腈定容至1 mL,渦旋搖勻后過0.22 μm濾膜,檢測回收率。

1.5 提取時間的比較

在使用往復水平振蕩作為提取方式下,確定最佳提取時間,以便實驗操作起來高效穩定,分別比較了水平振蕩5、10、15 min的提取效率。按1.2.1節所述方法加入乙腈進行提取,分別往復水平振蕩5、10、15 min,離心后吸取0.5 mL提取液于小管,加入0.5 mL實驗用水定容至1 mL,渦旋搖勻后過0.22 μm濾膜,檢測回收率。

1.6 凈化條件的比較

本實驗比較了4種常見的凈化方式:A.dSPE1高速離心管(每管含150 mg MgSO4和50 mg PSA);B.dSPE2高速離心管(每管含100 mg MgSO4、50 mg PSA和50 mg C18);C.Carbon-GCB SPE小柱(250 mg,3 mL);D.GCB/PSA SPE小柱(200 mg/200 mg,3 mL)。按1.2.1節所述方法進行提取,離心后需吸取1 mL乙腈提取液加入A和B方案中的d-SPE高速離心管,充分混合;吸取1 mL乙腈提取液潤濕C和D方案中的SPE小柱,SPE柱潤濕后棄去流出液,再加入2 mL提取液過柱并收集濾液,最后吸取0.5 mL凈化液,加入0.5 mL實驗用水定容至1 mL,渦旋搖勻后過0.22 μm濾膜,檢測回收率。

1.7 質譜條件的確定

分別將0.5 mg/L的目標物標準溶液用蠕動泵以10 μL/min的流速連續注射進入ESI離子源,在負離子模式下進行質譜分析,確定質譜儀器采集目標物時的各目標物質譜參數和儀器條件。

1.8 液相色譜條件的比較

在質譜參數確定的相同條件下對液相條件進行優化,選用了Thermo Accucore aQ(2.6 μm,2.1×150 mm)色譜柱,比較了3組不同組成的流動相,分別為乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、甲醇-5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸水溶液,最終確定對目標物分離效果和靈敏度最優的一組流動相。

1.9 六種植物性食品中氟蟲腈及其代謝物的測定

1.9.1 標準溶液配制 準確稱取各物質標準品10.0 mg于10.0 mL容量瓶中,乙腈稀釋至刻度,配制成各標準物質濃度為1000.0 mg/L的標準儲備液,該儲備液置于-18 ℃冰箱中保存,保存期兩年。標準曲線的配制:本實驗考察基質效應對于目標物響應值的影響,發現不同基質對于響應存在不同程度的抑制,故本實驗采用空白基質配制標準曲線,以盡可能的消除基質效應的影響。采用空白基質(蘋果、香蕉、大米、大豆、菠菜和茶葉),經1.2節提取凈化,分別配制成一系列標準曲線(0、0.1、0.2、0.5、1和5 μg/L),現配現用。

1.9.2 基質效應 在本研究中選擇了簡略的標準曲線法對基質效應進行了考察,對不含待測組分的蘋果、香蕉、大米、大豆、菠菜、茶葉陰性樣品,經1.2節前處理后,對得到的相應基質凈化液配制濃度一致的系列標準曲線,以化合物的響應值對相應濃度繪制標準曲線。

1.9.3 線性范圍和檢出限 本研究采用相應基質匹配標準曲線進行校準定量,配成一系列標準曲線(0、0.1、0.2、0.5、1和5 μg/L),以儀器響應峰面積對各目標化合物的質量濃度繪制基質標準曲線。

1.9.4 添加回收實驗 在蘋果、香蕉、大米、大豆、菠菜和茶葉6種空白樣品中進行3個水平的加標回收實驗,添加量為每種化合物1.0、2.0、4.0 μg/kg,每個水平均重復6次,以1.2和1.3節所述方法進行回收率實驗和精密度實驗。

1.9.5 實際樣品測定 按照1.2和1.3節所述方法對市售的100份蔬菜、50份水果、10份糧谷、10份茶葉進行氟蟲腈及其代謝物的檢測。

1.10 數據處理

上述數據經由美國Thermo Fisher公司TraceFinder EFS軟件和Excel統計分析所得,計算標準誤差并制圖。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

在所選提取溶劑用量一致(10 mL)的情況下,結果表明,乙酸乙酯和甲醇提取氟蟲腈及其代謝物的回收率均小于60%,而乙腈和丙酮的提取效率均較好,且回收率較高,但考慮到本文所選用的樣品基質較為復雜多樣,如果用丙酮提取,樣品基質中的大量色素、蠟質及脂肪等非極性成分進入提取液,使后面的凈化操作比較繁瑣,而乙腈則相對不容易提取上述雜質,提取液凈化操作簡便[14]。其次,對于干性樣品提取前需加入水使其充分浸濕溶脹,以保證提取溶劑與樣品充分接觸;再次,借助QuEChERS CEN EN-15662提取鹽包的作用,無水硫酸鎂吸水同時放熱,使萃取液溫度更適合農藥萃取,同時離心促使了樣品和乙腈提取層很好的分離效果,這樣既可以提高對目標物的提取效率,又可以減少樣品基質中主要干擾雜質的溶入量,對后續的凈化步驟有利。鑒于上述,故本方法最終采用乙腈溶液提取,操作簡單,凈化效果顯著,提取效率高。

2.2 提取時間的選擇

綜合6種植物性食品的提取時間結果表明,見圖1(以茶葉為例)水平振蕩15 min的提取效率并沒有明顯的優勢,因此,本文確定往復振蕩10 min足以達到較高的提取效率。

圖1 不同提取時間對目標物回收率的影響(茶葉為例)Fig.1 Effect of different extraction time on target recovery rate(tea as an example)

2.3 凈化條件的選擇

盡管經過QuEChERS提取步驟,但仍有一些極性和中等極性的雜質也被提取到乙腈中,如有機酸、色素、維生素等,針對這些雜質的性質,實驗比較了4種常見的凈化方式,通過回收率數據可以發現,不同凈化劑均對不同樣品有不同程度的凈化效果,結果如圖2所示。對于蘋果、香蕉、大米這三種基質,采用A方案和B方案均得到較佳的回收,綜合考慮價格成本后,本文推薦選用A方案凈化方式即可滿足要求。但對于含色素較多的菠菜、茶葉以及含較多脂肪的大豆,則是采用GCB/PSA復合小柱的凈化效果明顯優于其他3種吸附劑,這是由于GCB(石墨化炭黑)對平面結構分子有很強的親和性,對固醇、葉綠素、咖啡堿和兒茶素等雜質的去除能力較強;PSA吸附劑則是能有效除去來自樣品共萃取物中的脂肪酸、某些極性親脂性色素和糖類等。因此,本文選用GCB/PSA復合小柱作為大豆、菠菜、茶葉的凈化手段。

圖2 凈化條件的優化實驗Fig.2 Optimization of SPE-recovery

2.4 質譜條件確定

用蠕動泵以10 μL/min的流速連續注射,分別將0.5 mg/L的目標物標準溶液注入ESI離子源,在負離子模式下進行一級質譜分析(Q1掃描),得到準分子離子峰[M-H]-峰,確定母離子后,對離子源溫度、去簇電壓、鞘氣、輔助氣等參數進行優化,使其一級掃描響應達到最高。再對準分子離子峰進行二級質譜分析,得到響應較高的2個碎片離子分別作為定量離子和定性離子和各自對應的碰撞能量。

2.5 色譜條件的確定

根據氟蟲腈及其代謝物的化學結構,本文比較了3組不同組成的流動相,研究表明,甲醇-水溶液體系下氟蟲腈及其代謝物的分離效果和靈敏度要高于乙腈-水、甲醇-5 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸水溶液。故本項目采用甲醇-水溶液通過梯度洗脫,得到氟蟲腈及其代謝物的MRM譜圖,如圖3所示。

圖3 4種化合物標準溶液的多反應監測(MRM)色譜圖(1.0 μg/kg)Fig.3 MRM chromatograms of 4 compounds(1.0 μg/kg)注:A.氟蟲腈;B.氟蟲腈硫醚;C.氟蟲腈砜;D.氟甲腈。

2.6 基質效應

液相色譜-電噴霧電離(ESI)-串聯質譜法越來越多應用在食品安全檢測領域,ESI源離子化有明顯的基質效應(matrix effect,ME),即樣品溶液中的基質成分對分析物的離子化有抑制或增強作用,從而影響測定結果的精密度和準確度。一般采用同一來源的空白樣品配制系列標準溶液,使標準溶液和樣品溶液具有同樣的離子化條件從而消除基質效應給質譜定量帶來的影響[14]。

通過對標準曲線斜率的比較發現(見圖4),不同基質對于不同化合物的確存在基質效應,且絕大多數表現為抑制效應。實驗結果表明,茶葉的基質效應最大,菠菜次之。因此有必要采用相近空白基質配制標準曲線對樣品進行準確定量。

圖4 液相色譜-串聯質譜的基質效應考察(氟蟲腈為例)Fig.4 Matrix effect of LC-MS/MS(fipronil as an example)

表3 線性方程、相關系數及加標回收率、精密度(n=6)Table 3 Linear equations,correlation coefficients,average recoveries,relative standard deviation(RSD)

2.7 線性范圍和檢出限

采用相應基質匹配標準曲線進行校準定量,以儀器響應峰面積對各目標化合物的質量濃度進行線性回歸,線性關系良好(R2≥0.999)。依據3倍信噪比峰面積對應的4種化合物含量為定性限,10倍信噪比峰面積對應的化合物含量為定量限,經檢測計算,對于4種分析物的LOD均為0.02 μg/kg,LOQ為0.1 μg/kg。當實際樣品中的某化合物有檢出,應當采用相應的空白基質配制標準曲線對其進行定量,若含量超過線性范圍時,可適當加大樣品的稀釋倍數,并依據SANTE/11945/2015進行定性和定量[15]。

2.8 方法回收率和精密度

本實驗依據歐盟SANTE/11945/2015進行方法驗證,結果表明所建方法重復性良好,平均回收率為91.5%～101.5%,RSD為0.47%～3.88%,能夠滿足氟蟲腈及其代謝物同時分析的要求。

2.9 實際樣品測定

對市售的蔬菜、水果、糧谷、茶葉進行氟蟲腈及其代謝物的檢測,結果在2批次小白菜、1批次草莓中檢出氟蟲腈及其代謝物,按照GB2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》的要求,氟蟲腈及其代謝物之和以氟蟲腈表示,計算后濃度范圍均在0.051～0.153 mg/kg,均為不合格樣品。

3 結論

本研究基于國際食品法典及我國主要貿易國和地區對植物性食品中氟蟲腈及其代謝物的限量要求,建立QuEChERS凈化技術結合高效液相色譜-電噴霧電離串聯質譜法快速測定植物性食品中氟蟲腈及其代謝物的殘留量。目前,本方法已應用于日常檢測工作,通過一段時間對大量樣品的檢測,證實了該方法的穩定有效,而且在市售樣品中已檢出陽性樣品,對保護消費者的食品安全起到一定作用,該方法操作簡單、可靠、穩定,能夠滿足日本、歐盟等主要貿易國和地區的限量要求,有效避免了可能發生的貿易摩擦和損失。