蘆薈大黃素對培養人成纖維細胞Smad 2與I型膠原表達及細胞周期的影響*

楊成華 程基焱

1 西南醫科大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室,四川省瀘州市 646000; 2 達州職業技術學院

成纖維細胞主要分布于結締組織等部位。目前認為，成纖維細胞可以合成和分泌膠原蛋白及產生細胞外基質，在組織愈合、瘢痕產生等過程中扮演主要角色[1-2]。Smad蛋白存在于人和動物多種細胞中，參與調節細胞增殖、分化，對創傷修復等生理病理過程有重要作用，是轉化生長因子β(TGF-β)受體復合物的下游信號。Smad蛋白可以將TGF-β信號直接由細胞膜轉導入細胞核內。因此，Smad蛋白可能在成纖維細胞參與創傷修復及瘢痕愈合中起到重要的作用。蘆薈大黃素(Aloe-emodin)是大黃、蘆薈等多種中藥的有效成分，屬植物型藥劑。大黃、蘆薈在中國傳統醫學中已經有了悠久的歷史，除了可以用于中醫的辨證施治以外，還可以用于保健和日用化工品中，主要功效有利于護發和護膚[3-4]。

本研究通過用體外培養人成纖維細胞，用蘆薈大黃素進行干擾，檢測蘆薈大黃素對成纖維細胞的增殖及對其Ⅰ型膠原蛋白表達的影響，分析蘆薈大黃素對成纖維細胞相關生理活動的影響和意義，為成纖維細胞的功能調控、調控機制的研究及創傷愈合、疤痕修復等方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及主要試劑、設備 人皮膚成纖維細胞：皮膚來自于西南醫科大學附屬醫院普外科小兒包皮環切術皮膚真皮；蘆薈大黃素：上海晶都生物技術有限公司；量子點標記試劑盒：武漢珈源量子點技術開發有限責任公司；Ⅰ型膠原、Smad 2一抗：北京博奧森生物技術有限公司；熒光顯微鏡：日本 奧林巴斯(OLYMPUS，BX51)公司；BD FACSCalibur流式細胞儀：美國 BD公司。

1.2 細胞培養及分組干擾 將皮膚真皮原代培養，傳代，純化，細胞濃度為1.0×108/L，接種于24孔培養板(鋪蓋玻片)，即每組24例樣本量。培養條件：溫度37℃、小牛血清10%、DMEM培養基、CO25%。蘆薈大黃素以二甲基亞砜為溶劑溶解稀釋，分為3個不同劑量的組別，即低劑量組(50μg/ml treatment group，50-TG)，采用50μg/ml進行干擾；中劑量組(100μg/ml treatment group，100-TG)，采用100μg/ml進行干擾；高劑量組(500μg/ml treatment group，500-TG)采用500μg/ml進行干擾；以及對照組(control group，CG)0μg/ml。48h后終止干擾。取出細胞爬片，90%乙醇固定30min，進入后續實驗。

1.3 染色及檢測 量子點標記：細胞爬片經0.1% Triton-X 100，3%雙氧水處理，滴加1∶100稀釋的Ⅰ膠原蛋白一抗(鼠抗鼠)37℃ 4h，滴加1∶100稀釋的I膠原蛋白一抗(兔抗鼠)37℃ 4h，PBS洗滌，量子點標記二抗(抗鼠、抗兔)復合物37℃孵育20min，PBS洗滌，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察成像并照相，記錄觀察結果。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期 取培養細胞，用0.25%胰蛋白酶消化細胞成細胞懸液，離心，冰乙醇固定，離心。調整細胞濃度為5×105/ml，PI染液孵育。以488nm氬離子激光激發，每組取8例樣本量，應用BD CSCalibur(美國 BD公司)流式細胞儀的FAC Station、Cell QUEST Pro數據處理軟件系統進行細胞周期檢測和結果分析。

2 結果

2.1 量子點免疫熒光結果 干擾48h后，對照組和實驗組Smad 2顯示為綠色熒光，Ⅰ膠原蛋白顯示為紅色熒光(圖1、2)。分析結果顯示， Smad 2主要表達在細胞核，實驗組表達明顯增高，與對照組之間差異有統計學意義(P<0.05)；Ⅰ型膠原主要表達細胞質，實驗組表達明顯降低，與對照組之間差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 免疫染色熒光強度

注：*對照組與實驗組之間比較，P<0.05；△對照組與實驗組之間比較，P<0.05。結果*1P=0.018,*2P=0.008,*3P=0.011,△4P=0.001,△5P=0.003,△6P=0.003。

圖1 Smad 2免疫熒光染色結果(×200)

注：A：CG， B：50-TG， C：100-TG， D：500-TG。

圖2 I型膠原免疫熒光染色結果(×200)

注：A：CG， B：50-TG， C：100-TG， D：500-TG。

2.2 成纖維細胞流式細胞儀細胞周期檢測結果 對照組、實驗組G1期細胞所占比例比較，差異有統計學意義(P<0.05)；S期細胞所占比例，G2期細胞所占比例各組之間比較，無明顯變化規律，見表2。

表2 流式細胞儀細胞周期檢測結果

注：*與對照組比較，P<0.05,*1P=0.021,*2P=0.013,*3P=0.013。

3 討論

“無瘢痕愈合”(Scarless Healing)是指哺乳動物在創傷愈合后不留瘢痕的特殊現象，是創傷愈合的理想狀態。創傷后瘢痕的產生是由于創傷后大量膠原產生，是多年來困擾廣大醫患人員的難題。研究證實，人類胎兒無瘢痕愈合是胎兒的成纖維細胞在其特殊生理環境中產生細胞外基質的結果，并主要與成纖維細胞內在特性以及其產生的膠原蛋白類型有關。但無瘢痕愈合過程中并非因為胎兒創傷愈合后的基質中缺乏膠原，而主要是因為膠原在胚胎皮膚中的成分及排列等結構與成年皮膚表現出不同的特征。

膠原主要由成纖維細胞合成并分泌，是結締組織基質中的主要成分，其中Ⅰ型膠原是創面存在的主要膠原。Smad蛋白家族存在于人和動物多種細胞，對細胞增殖、分化、胚胎發育、創傷修復等生理、病理過程有重要作用。有報道稱Smad是轉化生長因子β(TGF-β)受體復合物的下游信號。其中Smad 2和Smad 3是介導TGF-β1作用的受體調節Smad蛋白，可能是TGF-β1信號下傳的第一個信號分子。因此，Smad 2、Smad 3可能在胚胎無瘢痕愈合中起到重要的作用[1-2，5]。

培養人成纖維細胞的Smad 2、Ⅰ型膠原的免疫熒光檢測顯示，該細胞在常規培養下均有Smad 2、Ⅰ型膠原蛋白陽性產物。該研究實驗結果顯示，Smad 2主要表達在細胞核，Ⅰ型膠原主要表達在細胞質。在培養中用蘆薈大黃素干擾后，Smad 2實驗組表達明顯增高，而Ⅰ型膠原蛋白實驗組表達明顯降低。由此可見，蘆薈大黃素可以促進體外培育人成纖維細胞中Smad 2的表達，但是抑制該細胞內Ⅰ型膠原的表達。結合本課題組的前期研究結果，胚胎無瘢痕愈合的主要機制可能為Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達差異及比例與成體成纖維細胞不同。因此可以認為，在體外培養人成纖維細胞中，該機制相似于胚胎成纖維細胞，Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達決定成纖維細胞的功能狀態不同，從而調控著是否有瘢痕形成的愈合機制。蘆薈大黃素對Smad 2、Ⅰ型膠原的調節，也說明其機制可能為通過調控Smad 2信號轉導途徑，達到調控膠原表達的目的，并對愈合及愈合的方式具有一定的意義[3，5]。

實驗中，在一定細胞密度內，成纖維細胞保持不斷增殖狀態。細胞則總是處于從G1、S、G2 和M期的周而復始的細胞周期中。在細胞周期對應的各階段，細胞分別進行著DNA復制、蛋白質合成及細胞分裂等重要的生理活動。實驗結果顯示，蘆薈大黃素有明顯升高G1期成纖維細胞的比例，G1期細胞比例相對于對照組來說，差異有統計學意義，而S期、G2期細胞比例無明顯改變規律。其結果說明，蘆薈大黃素對成纖維細胞的細胞分裂的影響，主要在細胞周期的G1期。其G1比例增高，則說明細胞在G1停留時間延長、細胞向G0發展的可能性增大、細胞出現功能相對停滯的可能性增大，則細胞不被活化的可能性增大。結合上述成纖維細胞中Smad 2、Ⅰ型膠原表達的特點及組織創傷后修復的過程及機制，可以推導出蘆薈大黃素可以適當抑制成纖維細胞的增殖，并避免創傷后成纖維細胞大量增殖并產生更多的膠原，聚集于創傷處不能降解，從而達到瘢痕組織減少的結果。這可能是大黃、蘆薈等含蘆薈大黃素的中藥可以抑制成纖維細胞的功能，調控無瘢痕愈合的作用機制之一[6]。

綜上所述，蘆薈大黃素對體外培養成纖維細胞的功能有明顯調控作用，可以促進Smad 2的表達，抑制Ⅰ型膠原蛋白的合成。同時，蘆薈大黃素可以延長成纖維細胞G1期，從而影響細胞的增殖及活性，可能是蘆薈大黃素可以達到調控愈合的作用機制之一。但中藥的作用機制研究極為復雜，關于蘆薈大黃素對愈合狀態的作用機制研究還需要大量的基礎實驗做進一步深入的研究和探討。