轉GbVe1基因在棉花基因組中的整合與定位分析

陳天子，凌溪鐵，楊郁文，張保龍

（江蘇省農業科學院/江蘇省農業生物學重點實驗室，江蘇 南京210014）

自從1997年我國審定第一個轉基因抗蟲棉后，轉基因抗蟲棉在國內推廣應用已達20余年，累計推廣面積超過3 000萬hm2，產生了巨大的社會效益和經濟效益[1]。伴隨著轉基因作物種植面積的持續擴大[2]，轉基因作物的知識產權保護、轉基因作物潛在的生態安全風險、轉基因產品的標識及其安全問題日益受關注。因此，明確轉基因作物的轉基因分子特征，是加強對轉基因作物及其產品的保護和安全監管的重要技術依據。

轉基因作物及其產品的分子檢測可通過基于核酸(如Polymerase chain reaction,PCR等)或蛋白（如Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA等）的系列方法進行。其中，PCR技術因具有高特異性、較高的檢測靈敏度、較低的檢測成本等優勢而成為轉基因檢測最常用的方法,尤以轉化體特異性檢測方法的特異性最高。轉化體特異性檢測是根據轉化載體T-DNA以及T-DNA插入位點側翼序列的融合序列而建立的PCR檢測技術，具有高度特異性。目前已有多個轉基因棉花轉化體的單個PCR特異性檢測[3-5]和多重PCR同時檢測[6]的報道。這些研究工作都是建立在棉花轉化體有明確的T-DNA側翼序列的基礎之上。

自抗蟲棉推廣以來，我國通過生產應用的轉基因抗蟲棉安全性評價材料已達2 000多份[1]，但大多數獲得批準的轉基因抗蟲棉花品種只簡單介紹導入基因的有限分子信息，并未明確其最初的轉化體來源，造成了轉基因轉化體的溯源和監管的困難。侯娜等[7]通過hiTAIL-PCR獲得轉基因抗蟲棉材料06N-119的5’端側翼序列，發現該側翼序列與汪巧等[8]采用Genome Walking方法獲得的轉基因抗蟲棉鄂雜棉1號的5’端側翼序列完全相同。通過序列比對發現，鄂雜棉1號和06N-119的側翼序列與專利US6893826中公開的MON757轉化體序列高度相似，推測鄂雜棉1號和06N-119中的轉基因轉化體均來源于MON757轉化體[5]。含有cry1Aa基因的轉基因棉花在我國和國外均未通過安全審批，但孫艾等在我國棉花商品種子中檢測出了cry1Aa基因[9]，王葉等隨后通過Genome Walking、長鏈PCR分離獲得含有cry1Aa基因的棉花轉化體NN6的整合結構全長序列，并建立特異性檢測方法[10]。由此可見，我國轉基因棉花的轉化體來源及其T-DNA側翼序列等相關分子特征信息還有待進一步完善。

棉花基因組序列的公布為研究棉花基因功能提供了契機，也為準確地鑒定棉花轉基因插入位點奠定了基礎。隨著棉花基因功能研究的不斷深入，將有更多的轉基因棉花涌現；明確棉花轉化體的T-DNA側翼序列將有助于我國轉基因棉花的良性發展。在前期研究中，我們利用農桿菌介導轉化方法將表面受體蛋白GbVe1導入了棉花基因組中，獲得了抗黃萎病的轉基因棉花材料[11]。本研究旨在利用hiTAIL-PCR技術[12]擴增轉GbVe1基因棉花T-DNA的側翼序列，明確外源基因在棉花染色體上的插入位點，建立特異性定性PCR檢測方法，并提供擴增含有pCAMBIA2301載體的轉化體邊界序列的特異引物，提高棉花轉化體的側翼序列分離效率，為我國轉基因棉花的安全評價和知識產權保護提供相關分子信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

抗黃萎病GbVe1基因過量表達的轉基因棉花由本實驗室通過農桿菌介導轉化棉花子葉和下胚軸而獲得[11]，含有基于pCAMBIA2301載體構建的、采用CaMV35S啟動子驅動GbVe1目的基因過量表達的植物表達載體（圖1a）。

Ex-Tap DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、DNA marker、pMD18-T載體等購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR產物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；DH5α感受態菌株等購自北京天根生物技術有限公司。PCR引物的合成和克隆片段的測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 轉基因棉花的Southern雜交檢測

取棉花幼葉3～5 g，采用CTAB方法[13]提取棉花基因組DNA，溶解300μL無菌水中。取1μL DNA在1.2%瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性，并根據DNA條帶亮度估算其濃度。然后取棉花基因組DNA 40μg，HindⅢ酶切后，經0.8%瓊脂糖凝膠低壓電泳并轉移到尼龍膜后，用地高辛標記的700 bp NPTII探針進行雜交。探針標記和雜交參照試劑盒DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（Roche公司）的說明書進行。

1.3 hiTAIL-PCR引物

LAD隨機簡并引物采用劉耀光等[12]所介紹的引物，LB端的特異引物根據pCAMBIA2301載體左邊界35S polyA終止子序列設計，RB端的特異引物根據pCAMBIA2301載體右邊界GUS基因和NOS終止子序列設計。特異引物使用Primer Premier 5.0軟件設計，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列及其位置見表1。

1.4 hiTAIL-PCR擴增體系和反應條件

hiTAIL-PCR擴增體系和擴增程序參考劉耀光等[12]方法，略有改動。第一輪pre-amplification反應體系為20μL，包括10.0μL 2×Ex-Tap pre-mix buffer、1.0μL 20μmol·L－1LAD1-1引物、1.0 μL 20μmol·L－1LAD1-3引 物（或1.0μL 20 μmol·L－1LAD1-2引 物、1.0μL 20μmol·L－1LAD1-4引物）、1.0μL 6μmol·L－1RBGUS-2引物（擴RB邊 界）（或1.0μL 6μmol·L－1LB35STR-4引物（擴LB邊界））、1.0μL 20～30 mg·L－1棉花基因組DNA、5.0μL無菌水。第二輪primary TAIL-PCR反應體系為25μL，包括12.5 μL 2×Ex-Tap premix buffer、1.25μL 6μmol·L－1AC1引物、1.25μL 6μmol·L－1RBGUS-4C引物（擴RB邊 界）（或1.25μL 6μmol·L－1LB35STR-3C1引物（擴LB邊界））、1.0μL稀釋50倍的Pre-amplification產物、9μL無菌水。第三輪secondary TAIL-PCR反應體系為25μL，包括12.5μL 2×Ex-Tap premix buffer、1.25μL 6 μmol·L－1AC1引物、1.25μL 6μmol·L－1RB-2a或RB-0a引物（擴RB邊界）（或1.25μL 6μmol·L－1LB35STR-2或LB35STR-1引物（擴LB邊界））、1.0μL稀 釋10倍的第二輪primary TAIL-PCR產物、9μL無菌水。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers in this study

1.5 側翼序列獲取和分析

第三輪secondary TAIL-PCR擴增產物經瓊脂糖電泳分離后，特異條帶用Axygen Axy Prey DNA Gel Extraction Kit回收純化，回收的PCR片段連接到pGEM-T easy載體，轉化大腸桿菌，每條片段的轉化克隆隨機挑8個單克隆菌落，用載體的通用M13引物進行PCR檢測，隨后取2個陽性克隆送測序。

1.6 側翼序列分析

測序獲得的序列合并成為FASTA格式文件，利用NCBI vector contamination（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）分析測序片段中的載體骨架序列，含有T-DNA載體的LB或RB端骨架序列以及未知序列的測序片段隨后與棉花基因組比對，從而判斷獲得的未知序列是否屬于插入位點的側翼序列。本文采取的棉花基因組版本是在phytozome網站picos測序方法拼裝的陸地棉TM-1基因組，可以視圖化地看出獲得的邊界序列在基因組的位置。

1.7 側翼序列驗證及轉化體特異性分析

為了驗證T-DNA插入位點的正確性，根據所獲得的LB、RB邊界側翼序列和T-DNA區段內的序列設計PCR特異引物，以12/100826-393株系T5代植株DNA為模板，特異性擴增T-DNA插入序列到其插入位點兩側的棉花基因組的序列片段，引物序列和位置分別見表1和圖1。

圖1 12/100826-393株系T-DNA插入位點的側翼序列及特異PCR引物的位置示意圖Fig.1 The T-DNA flanking sequences of transgenic line 12/100826-393 and specific primers on the flanking sequences

2 結果與分析

2.1 Southern雜交檢測

如圖2所示，利用內切酶HindⅢ酶切消化轉基因棉花DNA時，T-DNA區段將產生同時含有NPTII基因、Gbve1基因的6 057 bp（base pair）片段和單含GUS基因的2 938 bp片段；用NPTII探針雜交時，雜交帶預期的最小條帶為6 057 bp，故小于marker 5 148 bp的雜交信號不考慮，有效的雜交信號位于marker 5 148～21 226 bp之間?？椎?（野生型）和孔道7的樣品未檢出雜交信號，孔道3、4的樣品呈多拷貝插入，孔道5、6、8、9的樣品呈單拷貝插入。本研究候選孔道6、8、9對應的12/100826-393、7/100826-152、1/w-ch14等3個株系進行后續T-DNA側翼序列分析。

圖2 轉GbVe1基因棉花的T-DNA載體示意圖及southern blot結果Fig.2 The T-DNA construct and southern blot of transgenic GbVe1 cotton

2.2 側翼序列的擴增

取第二輪primary TAIL-PCR(一對引物)和第三輪secondary TAIL-PCR（兩對引物）擴增產物一起進行瓊脂糖凝膠電泳，結果發現各個引物組合均可獲取清晰的條帶，且第三輪擴增產物（0a、2a；R2、R1）略小于第二輪擴增產物（4c；3c），第三輪內側巢式引物（2a；R1）的擴增產物也略小于外側巢式引物（0a；R2）的擴增產物（圖3），符合預期。從圖3中可見，hiTAIL-PCR產物有多條帶，但一般僅有一條帶最亮，其中RB側翼序列擴增產生的平均條帶數為3.1條/反應，片段長度在250～1 300 bp之間，LB側翼序列擴增產生的平均條帶數為1.7條/反應，片段長度在250～800 bp之間。此外，第一輪采用LAD1-1/LAD1-3的擴增體系獲取的最終產物比采用LAD1-2/LAD1-4擴增的產物長，尤其是在對LB側翼序列進行擴增時尤為明顯。

2.3 側翼序列的克隆與分析

圖3 hiTAIL-PCR擴增轉GbVe1基因株系的T-DNA邊界序列Fig.3 hiTAIL-PCR results of T-DNA flanking sequences of transgenic GbVe1 cotton

根據hiTAIL-PCR特異引物位置可知，hi-TAIL-PCR正確擴增的產物應含有T-DNA序列和棉花基因組序列。本研究共計回收測序16條片段（圖2紅色箭頭所示），其中長度＞500 bp的回收片段10條，含T-DNA序列的片段有9條，hiTAIL-PCR正確擴增率90%；長度≤500 bp的回收片段6條，含T-DNA序列的片段僅有2條，hiTAIL-PCR正確擴增率33.33%。共計11條片段同時含有T-DNA序列及其旁側的未知序列（表2）。該11條片段進一步與TM-1棉花基因組比對，發現其上的未知序列均能比對到棉花基因組上，比對長度介于119～1 011 bp（表2），表明所獲得的片段即是T-DNA插入位點的側翼序列。另有編號1的片段，其2個測序克隆均不含T-DNA序列但含有未知序列，未知序列也能比對到棉花基因組序列，推測該片段可能是引物非特異性擴增棉花基因組的產物。

2.4 插入位點分析

將12/100826-393株系的側翼序列與Phytozome網站的TM-1棉花基因組比對，發現其4條RB側翼序列均源于D01染色體上的53 897 359～53 898 368區段，2條LB側翼序列源于D01染色體上的53 896 822～53 897 337區段（表3），RB和LB側翼序列間隔21 bp，表明T-DNA插入導致棉花基因組發生了21 bp堿基的缺失，該插入位點位于Gohir.D01G157600.1內含子（圖4）。

以同樣方法對另外兩個株系（1/w-ch14、7/100826-152）進行插入位點分析，發現7/100826-152株系的T-DNA插入位點也同在Gohir.D01G157600.1內含子上，推測這兩個株系可能是來源于同一個轉化事件。1/w-ch14株系的LB和RB側翼序列也能定位到Gohir.-D01G157600.1基因上，但另有其它RB側翼序列（表2的測序片段2和片段4）唯一地定位到A12染色體Gohir.A12G167400.1和Gohir.-A12G167500.1兩基因間的間隔區中，推測該株系可能不是單拷貝插入。

對12/100826-393株系的T-DNA側翼序列的AT含量進行分析，發現LB側翼序列的516bp堿基和RB側翼序列的1 008 bp堿基中的AT含量分別為63.4%和63.7%；對插入位點所處的基因序列分析，發現Gohir.D01G157600.1的AT含量為59.5%，說明T-DNA插入位點的側翼序列AT含量較高。

表2 hiTAIL-PCR獲取的轉GbVe1基因棉花T-DNA側翼序列Table 2 T-DNA flanking sequences in transgenic GbVe1 cotton by hiTAIL-PCR

2.5 轉化體特異性分析

根據獲得的側翼序列和T-DNA序列設計PCR引物（表1、圖1），以12/100826-393株系T5代植株DNA為模板，PCR驗證其插入位點的正確性。NOS終止子到RB邊界序列（圖5a）、35S終止子到LB邊界序列（圖5b）、GUS基因到RB邊界序列（圖5c）、NPTII基因到LB邊界序列（圖5c）和T-DNA區內GbVe1基因到NPTII基因的片段（圖5c）都在轉基因棉花中擴增出了預期目標片段，說明T-DNA插入及其側翼序列是正確的。進一步擴增GbVe1基因到RB邊界序列更長的片段，引物組合Gbvdr-1R＋R4獲得4.8 kb符合預期大小的特異帶，但條帶較弱；引物組合Gbvdr-1R＋R2（預期大小4.3 kb）則無擴增產物，可能是由于引物特異性不足。相比之下，引物組合Gbvdr-2F＋S11、Gbvdr-2F＋S21擴 增GbVe1基因到LB邊界序列獲得3.5 kb左右的特異帶（圖5d）。非轉基因植株（WT）在各個引物組合下均無任何擴增條帶，表明上述引物可以特異性地檢測T-DNA在Gohir.D01G157600.1內含子上的插入事件。

表3 轉基因株系12/100826-393的T-DNA側翼序列與棉花TM-1基因組的blast結果Table 3 The blast result of T-DNA flanking sequences of transgenic line 12/100826-393 with TM-1 cotton genome

圖4 轉GbVe1基因棉花株系12/100826-393的T-DNA及其側翼序列在基因組的定位示意圖Fig.4 The locations of T-DNA and flanking sequences in the genome of transgenic GbVe1 cotton line 12/100826-393

圖5 PCR驗證轉基因株系12/100826-393的T-DNA插入Fig.5 The confirmation of T-DNA insertion in the transgenic line 12/100826-393

3 討論

hiTAIL-PCR是獲取T-DNA側翼序列的高效方法，在水稻中擴增的成功率不低于90%[12]。采用同樣的簡并引物和反應體系，侯娜等[7]成功獲得了轉基因抗蟲棉的3’端側翼序列800 bp，但沒能獲得5’端側翼序列。這說明hiTAIL-PCR的高擴增率一方面得益于LAD簡并引物的高度簡并性，另一方面也依賴于錨定在T-DNA上的特異引物的有效性。為了克服單條LAD簡并引物在棉花上的兼容性不好，且鑒于第一輪pre-amplification反應體系混合采用兩條LAD簡并引物能比單條LAD簡并引物提高擴增產物的條帶數量[12]，本研究采用LAD1-1/LAD1-3或LAD1-2/LAD1-4對相同的DNA模板進行第一輪擴增。此外，為了確認hiTAIL-PCR擴增的特異性，我們在第三輪secondary TAIL-PCR擴增時采用2條巢式引物分別對第二輪primary TAIL-PCR產物進行獨立擴增。理論上，hiTAIL-PCR第三輪擴增產物比第二輪產物略小，且采用內側巢式引物擴增的第三輪產物比外側巢式引物擴增的第三輪產物也偏小。實際結果也符合預期，3個株系均能獲得擴增產物。本研究hiTAIL-PCR所用的特異引物用在其它含有pCAMBIA2301載體骨架的棉花轉化體上也成功獲得了T-DNA側翼序列，說明這些引物具有較好的特異性，可為含有類似基因結構的轉化體的T-DNA側翼序列研究提供借鑒。

本研究hiTAIL-PCR擴增RB端和LB端的產物都含有多條帶，這與在水稻中的結果一致，但水稻中大部分產物大于500 bp，多在1～3 kb[12]。本研究對hiTAIL-PCR不同長度的產物分別進行克隆、測序，結果表明90%大于500 bp的產物屬于hiTAIL-PCR正確擴增的；而小于500 bp的產物只有1/3左右是hiTAIL-PCR正確擴增的。所以，hiTAIL-PCR獲取T-DNA側翼序列時，盡可能選取大于500 bp的產物進行克隆、測序。但產物片段也不是越大越好，如本研究的片段1是最大的產物片段，含有能比對上棉花基因組的未知序列600～1000 bp，但其不含T-DNA序列，無法判斷其是否屬于T-DNA側翼序列，只能將其歸于非特異擴增的產物。

許多研究表明農桿菌介導的T-DNA整合到基因組有偏好性。左開井等[14]發現不同來源的轉基因抗蟲棉的T-DNA下游側翼片段為富含AT堿基結構,其中泗棉3號轉基因抗蟲品系中下游側翼片段的AT堿基高達92%。王曉波等[15]也發現抗草甘膦EPSPS基因插入的下游側翼片段為富含AT堿基(71.5%)結構，上游側翼片段也富含AT堿基（75.3%），且這些區域的基因密度相對較低。而李彥龍[16]則發現在農桿菌介導T-DNA整合到棉花基因組的過程中，T-DNA更偏好整合到基因區或轉座子區域。此外，T-DNA插入通常伴隨著插入位點序列的刪除或復制、T-DNA序列的部分刪除或復制、基因組的重排、染色體的易位或倒位等現象[17]。侯娜等[7]發現Bt抗蟲基因的插入過程中造成了75 bp的棉花基因組片段缺失。在本研究中，T-DNA插入位點位于基因的內含子上，插入位點上游和下游序列也富含AT堿基，T-DNA插入的導入造成了插入位點處的21 bp堿基丟失，同時T-DNA序列的LB端缺失12 bp，RB端缺失44 bp，推測T-DNA的插入位點可能與基因組中的重組熱點區域有關，但有待于更多的材料加以分析和印證。

4 結論

hiTAIL-PCR獲取了轉GbVe1基因棉花的T-DNA側翼序列，提供了T-DNA插入位點位于Gohir.D01G157600.1基因的內含子的特異性的檢測引物，并提供了適用于含有pCAMBIA2301載體骨架的轉化體的hiTAIL-PCR特異引物。