棉花導入系耐鹽性鑒定及耐鹽基因QTL定位

朱協飛，司占峰

（南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，南京210095）

我國鹽堿地面積達2.7×107hm2，鹽脅迫已成為限制土地生產力的主要因素之一[1]。隨著耕地面積的減少，棉花種植區域逐漸向鹽堿地集中，選用耐鹽品種是提高鹽堿棉田棉花產量的重要措施[2]。棉花是鹽堿地種植的先鋒作物[3]。棉籽在較高NaCl濃度下仍然能發芽[4]，但一般來講，當土壤含鹽量0.2%～0.3%時出苗困難，0.4%～0.5%時種子不能出土，大于0.65%時很難發芽[5]。NaCl主要影響種子吸水膨脹，造成萌發慢，萌發率低，鹽濃度越大，這種滲透脅迫越嚴重。出苗后，棉花從異養向自養過渡，此時鹽分脅迫引起幼苗畸形，子葉難展平，嚴重時葉綠素合成受阻、棉苗黃化。二、三葉期的棉苗體內已開始花芽分化，此時對鹽分最為敏感。鹽脅迫下，棉花葉片發軟、色暗、功能期短，脫落早，側根發生少、發生區黃褐色，干物質積累減少，生長停滯，甚至死苗。隨著鹽脅迫時間加長或強度加大，幼苗株高、葉面積、綠葉數、側根數等指標的減少量也越大。從干物質積累的根冠比來看，大多引起根冠比變大[6]，說明棉苗地上部所受傷害更大。劉國強等[7]對棉花4個栽培種4 078份品種資源的耐鹽性進行苗期鑒定表明，栽培種之間的耐鹽性差異很大，并且棉花的總體耐鹽性較差。李函利等[8]對179份來源不同的低酚棉種質資源的耐鹽性進行鑒定，沒有發現高抗材料，抗鹽材料占鑒定材料的2.2%、耐鹽材料占30.2%、鹽敏感材料占67.6%等。在棉花種質資源的耐鹽性鑒定指標方面，葉武威等[9]采用芽長和芽質量作為耐鹽鑒定指標，孫小芳等[10]采用相對出苗率、苗期對株高、相對葉面積作為耐鹽鑒定指標，沈法富等[11]采用棉花葉片總面積和葉片鮮物質質量減少的分數作為耐鹽鑒定指標。本研究采用NaCl處理后植株鮮物質質量增加量的變化為鑒定指標，以檢測各個導入系材料對NaCl處理的反應。

近年來，人們利用回交，結合分子標記輔助選擇技術，構建了大規模染色體片段導入系（Chromosomal segment introgression lines，CSIL），并且在水稻、玉米、小麥、棉花等作物育種實踐中取得了重要進展[12-24]。但對染色體片段導入系耐鹽性狀的遺傳研究報道很少。王鵬等[20-21]利用陸地棉TM-1與海島棉7124為親本培育了海島棉染色體片段導入系，該套導入系共有174個家系，包含298個染色體片段，導入片段總長度2 329.2 cM，覆蓋長度1 433.6 cM，覆蓋了棉花基因組81.3%。利用該導入系精細定位了與品質性狀、產量性狀相關的QTLs（Quantitative trait loci），為染色體片段導入系在育種中的應奠定了基礎[21]。本文選取了王鵬等[20-21]培育的海島棉染色體片段導入系的148個家系進行耐鹽性鑒定，并對耐鹽相關QTL進行定位，以期明確這類導入系種質資源的耐鹽性水平，篩選耐鹽性好的種質資源，為耐鹽育種和耐鹽基礎研究提供重要的資源材料和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為本課題組利用海島棉7124（提供染色體片段）與陸地棉TM-1培育的148份染色體片段導入系，分別命名為CSIL001～CSIL148。以導入系供體親本海島棉7124與輪回親本陸地棉TM-1作為對照品種（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1材料種植與試驗設計。試驗于2016年5～6月在安徽省當涂縣南京農業大學皖江基地進行。經硫酸脫絨后，每份材料中各挑選72粒飽滿一致的種子，采用穴盤育苗方式播種。穴盤規格：12孔/行×6行，育苗塞高度7 cm，播種面4 cm×4 cm。每穴盤播種2個材料，每個材料播種3行，設為3個重復，留苗36株，處理前后選擇27株較均勻一致的苗分別稱取質量統計。

棉花耐鹽性鑒定采用NaCl脅迫法[3]。因此本研究以NaCl處理來檢測導入系耐鹽性，并計算鹽害系數。

試驗設置3個處理。處理1：5月10日播種，6月1日稱鮮物質質量。處理2：5月10日播種，6月1日托盤中加水2.2升（加滿整個托盤），6月10日稱鮮物質質量。處理3：5月10日播種，6月1日托盤中加入與處理2等量的25 g·L－1NaCl溶液，6月10日稱取鮮物質質量。

1.2.2鹽處理與鹽害統計方法。鹽濃度確定：在多次試驗基礎上，將NaCl質量濃度確定為25 g·L－1。

鹽害系數計算參照張國偉的方法[2]。即：鹽害系數＝（對照值－處理值）/對照值×100%。本試驗對照值、處理值分別采用相對生長量值。即：對照值＝處理2－處理1，處理值＝處理3－處理1。

1.2.3QTL定位方法。結合已有導入系的分子鑒定數據[21]，利用QTL IciMapping 4.0軟件進行耐鹽性狀QTL定位，以LOD≥2.5作為閾值分別來判斷具有加性效應的QTL是否存在，并分析其特征。

2 結果與分析

2.1 148個導入系及2個親本3個處理的植株鮮物質質量統計及鹽害系數計算

6月10日觀察，與處理2相比，處理3多數材料表現出明顯的鹽害癥狀（圖1）。

表1列出了148個導入系及2個親本3個處理的植株鮮物質質量及鹽害系數。由于部分材料高度感鹽，處理3鹽脅迫10 d后，其鮮物質質量反而低于處理1，導致鹽害系數大于100%，表中均以100%列出。從表1可以看出，供體親本海7124、受體親本TM-1的鹽害系數分別為29.35 %、71.70%。148個導入系的耐鹽性差異較大，鹽害系數為1.34%～100%，平均鹽害系數為61.22%，介于兩個親本之間，表明導入的染色體片段長度及位置差異會導致導入系的耐鹽性差異，甚至會降低導入系的耐鹽水平。

表1 導入系鮮物質質量及鹽害系數Table 1 Fresh weight of Introgression lines and their salt damage coefficients

表1 （續）Table 1(continued)

圖1 部分材料生長情況比較Fig.1 Seedlings comparison under different treatments

以兩個親本的鹽害系數為界線，把148個導入系的鹽害系數分成3組，鹽害系數在0～29.35%的導入系有35個，占23.65%；鹽害系數29.35%～71.70%的有58個，占39.19%；鹽害系數71.70%～100%的有55個，占37.16%。表明有37.16%的導入系耐鹽性降低，但62.82%的導入系耐鹽性有所提高，23.65%的導入系耐鹽性優于兩個親本。說明從陸地棉背景的海島棉染色體片段導入系中進行耐鹽材料篩選是可行的。

2.2 導入系耐鹽性狀的QTL定位

利 用QTL IciMapping 4.0（http://www.isbreeding.net）檢測CSIL群體中耐鹽性狀QTL所產生的加性效應，以LOD≥2.5作為閾值分別來判斷具有加性效應的QTL是否存在，結果見表2。

共檢測到23個耐鹽相關的QTLs，分布在9條染色體上，其中11個QTL加性效應表現為正值，貢獻率在1.18%～2.29%之間，表明NaCl處理嚴重影響了植株的生長；12個QTL加性效應表現為負值，貢獻率在1.11%～3.18%之間，表明NaCl處理對其影響較小，對應的染色體片段含有耐NaCl基因，可在改良棉花抗鹽性上加以利用。我們還發現，耐鹽相關QTLs呈現染色體聚集分布，其中A02、A03、D01、D02和D07上都至少有2個不耐鹽的QTL，而A05、A12、D05和D11上都至少有2個耐鹽的QTL，其他染色體未檢測出耐鹽相關的QTL。尤其是A5和D5兩條染色體共檢測出7個耐鹽相關QTL，因此在抗逆育種中針對特定染色體的選擇能大大提高選擇效率。

表2 耐鹽性狀QTL定位Table 2 Mapping of QTLs for salt tolerance-related traits

3 討論

一般認為，棉花幼苗苗齡小，苗體嫩，但體內已開始花芽分化，對鹽分脅迫比較敏感，極易遭受土壤中鹽分毒害而導致生育緩慢甚至死苗[7,25]。因此在棉花耐鹽性鑒定時，鹽濃度的高低將對試驗結果產生重要影響，甚至決定試驗成敗。Levittd等認為棉花生長的極限鹽度為0.6%～0.7%[26]。由于試驗方法不同，本研究參考前人研究成果，并在多次試驗基礎上，將鹽質量濃度確定為25 g·L－1，試驗結果良好。

對于棉花耐鹽性鑒定方法，前人多采用雙層濾紙法研究棉花萌發出苗期的耐鹽性[27-28]，但棉花種子上帶有一定的真菌，這些真菌在濾紙上容易感染，增加了試驗誤差。本試驗采用穴盤育苗方式播種，與大田生產育苗方法一致。對苗期植株相對生長量進行耐鹽性鑒定，方法簡單、直觀，實際操作更接近大田生產。

目前耐鹽性狀的QTL定位已普遍用于水稻、玉米等作物的分子育種研究[29-31]，在棉花中研究報道較少。郭紀坤[32]利用（魯棉97-8×蘇12）F2分離群體，檢測到4個與抗鹽相關的QTL位點，貢獻率為5.47%～17.20%。George Oluoch[33]利用陸地棉品種中棉所12和野生棉毛棉的種間雜交F2:3家系進行耐鹽性QTL定位，共有11個QTL在至少兩個環境中被定位到，分布于8條染色體（A09、A11、D01、D07、D08、D09、D11和D12染色體），在兩種環境下單個位點分別解釋了11.97%和18.44%的表型變異，其中D11染色體檢測到的位點與本研究中檢測到的位于相近的位置。將陸地棉背景的海島棉染色體片斷導入系作為研究對象進行耐鹽性狀的QTL定位未見報道，因此，本研究在棉花耐鹽基因資源挖掘有一定的創新意義。

4 結論

本研究以148份陸地棉背景的海島棉染色體片斷導入系為研究對象，利用苗期植株相對生長量進行耐鹽性鑒定，發現導入系耐鹽性差異較大，總體耐鹽水平較高，有35個材料的鹽害系數在0～29.35%之間。進一步進行耐鹽性狀的QTL定位，檢測到了23個鹽害相關的QTL，其中12個抗鹽QTL，聚集分布在A05、A12、D05和D11染色體上，有一個QTL與前人研究檢測到的QTL位于相近的位置。因此，這些導入系中的部分材料可以作為耐鹽資源，進行耐鹽育種及相關研究，對特定染色體的篩選會具有更高的效率。