棉花U3和U6啟動子在CRISPR/Cas9基因組編輯體系中的功能鑒定

藏旭陽，代培紅，李繼洋，蒲艷，顧愛星，劉曉東

（新疆農業大學農學院/新疆農業大學農業生物技術重點實驗室，烏魯木齊830052）

棉花是我國重要的經濟作物、紡織工業原料和國家戰略物資，其相關產業是國民經濟體系的重要組成部分。解放后我國棉花種植業經歷了幾十年的蓬勃成長，棉花的總產量及單位面積產量得到了成倍的增長。然而棉花生產依然面臨很多問題，如新疆土地鹽堿嚴重，干旱缺水，導致大量土地不能充分利用[1]，另外干旱和鹽堿脅迫也影響棉花農藝形狀、產量和品質等[2]；棉花枯、黃萎病大面積發生，對棉花生產造成嚴重危害[3-4]。棉花品質低、成本高，導致棉花大量積壓、植棉效益低下。為解決這些問題就需要培育出抗病抗逆優質高產的棉花新品種，而創制出這些新品種最終需要棉花生物學創新作為理論基礎，需要棉花功能基因組學來解析農藝性狀調控的基因網絡[5-6]。但是廣泛種植的棉花是異源四倍體，其基因組大而復雜，棉花基因功能的研究存在巨大困難。而基因組編輯技術的誕生則為棉花基因功能的研究和棉花農藝性狀的基因調控網絡解析提供了強大的技術解決工具。不僅如此，基因組編輯技術還可以用來創造出更多優異的棉花育種材料[7-8]。

ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是 三大主 要基因組編輯技術，其中CRISPR/Cas9技術簡單、高效、靈活、方便等優點而為廣大科研工作者所接受[9]。U3或U6啟動子具有明確的轉錄起始位點，是CRISPR/Cas9基因編輯技術體系的重要元件。目前前人已利用植物自身的U3或U6啟動子，在擬南芥、玉米、棉花、水稻、煙草、大豆等物種中成功建立了CRISPR/Cas9基因組編輯技術體系[10-14]。金雙俠等[15]建立的啟動子誘捕系統中的GUS基因高頻率、多模式和時空特異性表達為分離基因及其調節序列、開展功能基因組研究奠定了堅實的基礎。

雷建峰等[16-18]從海島棉品種新海16中克隆了2個GbU3啟動子、5個GbU6啟動子，并驗證它們在棉花中具有轉錄活性，但是這些啟動子能否在CRISPR/Cas9體系中實現對棉花內源基因的編輯功能，目前還不很清楚。李繼洋等[19]利用雷建峰已驗證具有活性的其中2個啟動子建立棉花的CRISPR/Cas9基因編輯技術體系，在新海16胚性愈傷組織中成功實現基因的靶向編輯，編輯效率約為27%。

通常CRISPR/Cas9基因編輯體系一次只能編輯1個基因，而對于多基因控制的遺傳表型解析就顯得效率低下。為此Ma等[20]構建了由多個U3和U6啟動子驅動sgDNA并串聯的CRISPR/Cas9基因編輯體系，能在擬南芥和水稻中同時編輯多個基因，大大提高了多基因編輯的效率，但該載體系統需要多個不同的U3和U6啟動子。

基于以上的研究，為了驗證其他具有轉錄活性的U3、U6啟動子是否也能實現高效的編輯效率，為此本研究對克隆的GbU3-2P、GbU6-7P進行功能鑒定，篩選出更多能用于棉花CRISPR/Cas9基因編輯技術體系的U3和U6啟動子，為構建棉花CRISPR/Cas9基因多敲技術體系提供更多有效的U3和U6啟動子。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

原生質體制備所用的供試材料為新海16，由新疆農業大學農學院實驗室保存。限制性內切酶購于Thermo公司；纖維素酶和離析酶由IUZMI株式會社代理提供，T4DNA連接酶、Blunt Zero平端載體、Trans5α感受態細胞、Taq DNA聚合酶、RNase A、1kb Plus DNA Ladder等均購自于北京全式金生物技術公司；Phusion超保真DNA聚合酶購于北京NEB公司。測序及引物合成均由新疆昆泰銳生物技術有限責任公司完成。T-GbU3-2P-5F-2::GUS-sgRNA，T-GbU6-7P-5F-6::GUS-sgRNA載體由本實驗室保存[17-18]。35S-Cas9-ter-SK質粒由中科院上海生理生態研究所提供[21]。

1.2 載體構建

1.2.1棉花GGB基因編輯靶位點的設計選擇與靶向片段的制備。本研究選取的啟動子為GbU3-2P、GbU6-7P。GGB靶基因序列（sgRNA）如表1。靶序列設計在PAM(5'-NGG-3')（the protospacer-adjacent motif）位點前，長度為24個堿基（bp），并在PAM位點5'上游的切割位點處為限制性核酸內切酶識別位點。退火反應體系為20μL，上下游靶序列各10μL（表1）；復性程序為：起始溫度95℃，每5 s降低0.5℃，直至20℃，形成雙鏈靶序列。

最后該靶序列經退火復性插入到經BbsⅠ酶切的T-GbU3-2P-5F-2::GUS-sgRNA，T-GbU6-7P-5F-6::GUS-sgRNA載體上（圖1）。

1.2.2基因編輯載體的構建。將實驗室之前構建好的T-GbU3-2P-5F-2，T-GbU6-7P-5F-6載體[17]保存菌液，搖菌（200 r·min－1，37℃，12～14 h）進行提取質粒。

對T-GbU3-2P-5F-2::GUS-sgRNA，T-GbU6-7P-5F-6::GUS-sgRNA載體進行酶切（BbsⅠ），電泳檢測出現兩條帶（一條是GUS基因，條帶長1 918 bp；一條是載體，條帶長3 500 bp左右），回收目的片段。將靶序列與回收片段用T4連接酶連接過夜，使靶序列連接到經BbsⅠ酶切的載體相應位置上，使靶序列替換GUS片段，將U3/U6-靶序列-sgRNA載體，轉化Trans-5α感受態細胞，對重組質粒進行酶切（KpnⅠ，HindⅢ）回收（GbU3-2P::靶序列-sgRNA、GbU6-7P::靶序列-sgRNA）。同時對35s-Cas9-ter-SK質粒用KpnⅠ、HindⅢ酶切，并回收35s-Cas9-ter片段分別與目的片段用T4連接酶進行連接、轉化后對重組質粒用HindⅢ和KpnⅠ進行酶切鑒定，鑒定正確的質粒命名為GbU3-2P::GGB-sgRNA-Cas9、GbU6-7P::GGB-sgRNA-Cas9。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Primers used in this study

圖1 靶序列插入位置示意圖Fig.1 Inserted position of target sequence

1.3 富集高濃度PCR片段

對帶有靶序列的載體進行Polymerase chain reaction（PCR）擴增，以富集到高濃度CRISPR/Cas9基因編輯的核心片段。具體方法參見李繼洋等文章[19]，采用超保真TransStart FastPfu Fly擴增帶靶基因序列的編輯載體和空載體的核心系統區域，擴增體系參照說明書推薦體系，擴增片段覆 蓋 有GGB靶 序 列 的GbU3-2P::sgRNA、GbU6-7P::sgRNA及35S-Cas9-ter兩個核心元件和沒有GGB靶序列的對照空載體核心元件，瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后采用酚氯仿抽提和酒精沉淀法對其產物加以簡單純化。

1.4 原生質體的制備與轉化

參考擬南芥已經建立的原生質體分離方法[22]，采用纖維素酶和離析酶雙酶體系制備棉花葉片的原生質體，略有改動。

首先配制含有1.5 %纖維素酶、0.4 %離析酶、0.5 mol·L－1甘 露 醇、20 mmol·L－1KCl、20 mmol·L－1MES、0.85 mL ddH2O，55℃水 浴10 min，充分溶解后，室溫放置冷卻后，再加入0.1 mol·L－1CaCl2、0.1% BSA的混合酶液5 mL，經0.45μm纖維素微孔濾膜過濾待用。

其次取15 d左右幼苗（真葉剛展開）的新鮮健壯的的子葉7～8片。用蒸餾水清洗表面，在吸水紙上晾干待用。準備好刀片和鑷子，將下表皮撕去，之后葉肉細胞將裸露出來，平展于培養皿中，再用刀片將撕去表皮的部分切割成細長條，用鑷子輕輕將去表皮的葉面置于酶解液中，使葉片完全浸泡在酶解液中。放置在回旋搖床上酶解（50 r·min－1）10～14 h，直至子葉葉肉完全酶解，酶解液成綠色為止。

待原生質體酶解結束后，將酶解混合液慢慢混合均勻，取斜面槍頭蘸取含原生質體酶解混合液滴在載玻片上，室溫下靜置3～5 min，放在顯微鏡下觀察原生質體的形態，拍照并做記錄。若形態符合試驗要求，就用少量的W5溶液重懸后，用槍頭輕輕吸取10μL原生質體混合液，把蓋玻片（18 mm×18 mm）放置在血細胞計數板上，將原生質體懸浮液從側面緩緩打入到載玻片上，計算出原生質體的個數，重復3次統計。

最后原生質體制備好后，配制W5溶液（4 mmol·L－1MES、125 mmol·L－1CaCl2、154 mmol·L－1NaCl、5 mmol·L－1 KCl）、MMG溶液（0.4 mol·L－1甘露醇、15 mmol·L－1MgCl2、4 mmol·L－1MES）和WI溶液（0.5 mol·L－1甘露醇、20 mmol·L－1KCl、4 mmol·L－1 MES），取10～15μg富集的PCR產物，參照擬南芥原生質體轉化的方法[23-24]將富集產物轉化至棉花原生質體，于28℃，50 r·min－1避光過夜孵育轉化后的原生質體。

1.5 編輯效應的檢測

過夜孵育轉化后的原生質體經鏡檢拍照后，采用12 000 r·min－1離心1 min收集沉淀，棄去上清液后，將棉花原生質體用植物基因組DNA提取試劑盒提取棉花原生質體基因組DNA，方法參照Trans Easypure plant Genomic DNA Kit操作要求，將提取的DNA經過濃度檢測后，取等質量提取的DNA，在靶序列上找酶切位點（GbGGB采用ScaⅠ酶切）進行過夜酶切和不酶切2種處理，分別以2種處理的原生質體DNA為模板進行PCR檢測，PCR反應體系參照NEB公司Phusion超保真DNA聚合酶推薦反應體系，采用先酶切后PCR的方法對靶序列內突變位點進行檢測[19]，通過瓊脂糖凝膠電泳出現亮帶情況，進行回收，初步檢測出突變的PCR產物，然后克隆、測序，采用DNAstar和DNAMAN軟件進行序列比對分析，檢測棉花GGB靶序列內是否有突變位點。根據GGB靶序列的測序結果，計算突變率。

1.6 靶基因內不同區域突變頻率的計算

為了排除出現的堿基突變是PCR過程中引入隨機突變的可能性，為此對酶切前的棉花基因組DNA進行PCR擴增，引物見表1（Test系列），對擴增產物進行克隆。隨機挑選100個長勢均一的單菌落測序，通過DNAstar軟件比對測序結果，以40個堿基為一個計算單元，統計包括靶序列區及其前后各2個40 bp區域突變堿基數，并計算相應區域堿基突變的頻率，利用制圖軟件繪制Test區域堿基突變頻率折線圖。

2 結果

2.1 編輯載體構建

采用酶切方式檢測上述構建的載體，結果表明構建載體大小符合預期設計，構建帶有靶序列的U3:sgDNA、U6:sgDNA（圖2），連接的GbGGB靶序列的GbU3-2P、GbU6-7P不同啟動子的Cas9的編輯載體均于構建成功（圖3）。

圖2 構建帶有靶序列的U3:sgDNA、U6:sgDNAFig.2 Construction of U3:sgDNA and U6:sgDNA with target sequence

圖3 GbU3-2P::GGB-sgRNA-Cas9、GbU6-7P::GGB-sgRNA-Cas9基因編輯載體的酶切鑒定Fig.3 Identification of GbU3-2P::GGB-sgRNACas9、GbU6-7P::GGB-sgRNA-Cas9 gene editing vectors using restriction enzyme digestion

2.2 原生質體制備與轉化

體系優化獲得的原生質體在顯微鏡下呈圓球狀，形態飽滿，符合去壁細胞形態，經計算其數量可達106mL－1以上，通過顯微鏡檢測觀察顯示，僅極少原生質體呈破碎狀態，證明使用該體系制備的原生質體可以滿足本研究的后續試驗要求。經轉化并過夜孵育后的原生質體，有少量細胞成簇聚集現象，再次在顯微鏡下觀察細胞活性狀態，說明轉化后的棉花原生質體狀態良好（圖4）。

圖4 棉花原生質體轉化前后形態圖Fig.4 Morphological change of cotton protoplasts before and after transformation

2.3 CRISPR/Cas9介導的棉花GGB基因靶位點的編輯和突變檢測

將構建好的基因編輯載體進行轉化，對獲得的原生質體基因組DNA進行不酶切和酶切兩種處理，然后以此為模板進行PCR擴增，結果如圖5（1）（2）所示，酶切前攜帶靶基因序列的載體轉化樣品和空白對照載體轉化樣品都能擴增出預期500 bp左右的條帶，并且亮度相近。而經ScaⅠ酶切后攜帶靶基因序列的載體轉化樣品，由于靶區域限制性內切酶識別位點被編輯突變，限制性內切酶不能進行切割，維持了模板DNA的完整性，則PCR擴增出預期條帶的亮度比用ScaⅠ酶切后的空白對照載體的亮。

本試驗對酶切后PCR片段進行回收連接、克隆并送測序，通過測序結果比對發現，在棉花新海16 GGB內靶位點有個別堿基發生突變的現象。發生突變的位置位于PAM位點上游限制性內切酶位點區域的基因靶位點上，GbU3-2P、GbU6-7P啟動子的CRISPR/Cas9基因編輯載體均出現不同類型的突變（圖6），全部為堿基置換（包括轉換和顛換兩種類型）。

為了排除堿基突變是由于PCR過程中引入隨機突變的可能性，為此對酶切前的轉化原生質體的基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物克隆，隨機挑選100個陽性候選單克隆菌落測序，通過DNAstar軟件比對測序結果，以40個堿基為一個計算單元，對包括靶序列區及其前后各2個40 bp區域堿基突變個數進行統計，并計算相應區域堿基突變頻率，利用制圖軟件繪制Test區域堿基突變頻率折線圖。結果顯示靶序列20個堿基區域內的堿基突變頻率遠遠高于兩側相鄰各2個40 bp區域內堿基的突變頻率（圖7）。

上述結果證明基于海島棉GbU3-2P、GbU6-7P啟動子的CRISPR/Cas9基因編輯載體系統均能棉花中實現靶向基因編輯的功能。

圖5 酶切/PCR檢測CRISPR/Cas9基因組編輯效應Fig.5 Digestion/PCR for editing effect of CRISPR/Cas9

圖6 GbGGB-sg RNA靶位點編輯效應(堿基置換型)測序檢測結果Fig.6 Sequencing of GbGGB-sgRNA target site that were edited(type of base substitution)

圖7 Gb GGB-sg RNA2靶位點區域(guide RNA)及其兩側位點的突變效率分析Fig.7 Mutation efficiency of GbGGB-sg RNA2 target site(guide RNA)and its two flanking region

3 討論

由RNA介導的CRISPR-Cas9基因編輯系統，作為一項全新的第三代人工核酸酶技術，其載體構建簡單、成本消耗低，是作物功能基因組學和分子育種研究的強有力的工具，目前CRISPR/Cas9系統已經應用于多種植物的基因組編輯研究[25]，該技術在植物中的研究已逐漸趨于成熟，而CRISPR/Cas9基因組編輯技術剛剛在陸地棉中成功建立[26]。但利用棉花內源U6或U3啟動子在棉花中建立CRISPR/Cas9基因編輯系統的應用報道卻很少。雷建峰已經從棉花中克隆了2個U3啟動子、5個U6啟動子，并驗證它們在棉花中具有轉錄活性[18]，但是基于這些啟動子的CRISPR/Cas9系統能否在棉花中實現對內源基因的編輯，目前還不清楚。本研究利用已克隆的1個棉花內源的U3啟動子和1個U6啟動子構建了棉花的CRISPR/Cas9基因組編輯技術體系并成功地實現了基因編輯效應，為建立多敲CRISPR/Cas9基因組編輯技術體系提供了更多的啟動子。

3.1 CRISPR/Cas9基因組編輯效應檢測

采用先酶切后PCR的方式是一種簡單、快速、有效的檢測基因編輯效應的方法。Chen等[11]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統對陸地棉的兩個基因（GhCLA1和GhVP）在棉花子葉原生質體中進行了定點突變研究，試驗結果表明靶標位點大多數情況是單個堿基的替換，少數是單個堿基的刪除或插入。本研究利用已克隆的GbU3-2P、GbU6-1P、GbU6-7P啟動子構建了棉花的CRISPR/Cas9基因組編輯技術體系并在新海16葉片原生質體中進行功能鑒定，結果顯示靶位點的突變類型全部為堿基替換，未檢測到堿基缺失和堿基插入，這與Chen等[11]的研究結果類似，但穩定轉化能檢測到較高頻率的堿基缺失和堿基插入?？赡艿脑蛞皇桥c穩定轉化相比，原生質體瞬時轉化的基因編輯系統的相關成分在原生質體中表達水平較低，且不能持續穩定表達，也就不能高效持續切割靶序列，而獲得靶序列破壞嚴重的結果。第二方面的原因可能是選用的U3和U6啟動子轉錄活性不高，不能高效產生SgRNA去引導Cas9高效持續切割靶序列。原因3可能是我們測序的克隆數依然偏少，沒能檢測到本來就比例偏少的插入和缺失克隆，進一步擴大測序的克隆數，可能就能檢測到插入和缺失的突變類型。

空載體對照轉化樣品的模板DNA不會被編輯突變，限制性內切酶可以進行切割，理論上應該不會出現PCR擴增產物。然而我們空載體轉化樣品卻出現了較弱的PCR條帶，盡管我們增加了限制性內切酶量，也延長了酶切的時間，但對照依然有PCR產物。原因可能是棉花屬多糖多酚植物，基因組在提取過程中殘留的多糖和酚類物質在酶切反應時都可能抑制限制性內切酶活性，導致靶序列模板酶切不徹底，再經PCR擴增時，對照樣品基因組DNA酶切后PCR產物依然還有微量的條帶[27-28]。

PCR擴增常常會引入隨機的堿基錯配，即使使用高保真的DNA聚合酶，也會如此。本實驗中靶序列單堿基的改變是否是因為PCR擴增過程中堿基隨機配對錯誤產生的突變？為排除這個可能性，對靶位點及靶位點兩側的DNA序列突變的頻率進行了測定，結果顯示非靶序列位點處確實也可以檢測到單堿基替換，但其突變的頻率遠低于靶位點堿基的突變頻率，表明靶序列區堿基的突變確實是CRISPR/Cas9系統靶向編輯的結果。本研究結果表明棉花內源U3-2P、U6-7P啟動子實現了CRISPR/Cas9介導的棉花基因組靶向編輯，克隆測序結果發現靶位點的突變多為堿基的替換，這與海島棉、陸地棉原生質體中的基因編輯結果類似。

4 結論

本研究證明了棉花內源U3-2P、U6-7P啟動子均能有效地驅動sgRNA的轉錄，實現CRISPR/Cas9介導的棉花基因組靶向編輯。該體系可以用于定向創制棉花的突變體，為棉花功能基因組學研究提供重要的技術工具。