乳清蛋白組分在脫脂乳和乳清體系中熱變性率的比較研究

麻志寧，王媛媛，李紅娟，李洪波，于景華

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.梅花生物科技集團股份有限公司，河北廊坊065000）

0 引 言

乳清蛋白是脫脂乳粉的優質蛋白，不僅影響脫脂乳粉的營養價值，也與脫脂粉的多種應用特性有關。它通常由球狀蛋白質組成，β-乳球蛋白(β-Lg)，α-乳白蛋白(α-La)和牛血清白蛋白（BSA）是乳清蛋白中的主要蛋白質[1]。預熱一般為脫脂乳粉加工的關鍵階段，在殺菌加熱條件下，乳清蛋白易發生變性和聚合，對乳清蛋白天然狀態和穩定性會產生顯著影響[2-3]。相比之下，酪蛋白熱穩定性較高，在加熱處理的常規條件下一般不產生變性[4]，但當加熱溫度達到某種程度也與變性的乳清蛋白產生聚合，聚合物主要分成：（1）β-Lg與酪蛋白的聚集物，主要是β-Lg-κ-酪蛋白復合物[5]；（2）隨著加熱溫度升高，變性的α-La附 著在β-Lg-酪蛋白表面使其進入膠束相[6]；（3）通過對牛乳的加熱，因乳清蛋白中包含的二硫鍵和巰基，導致β-乳球蛋白的疏水基團暴露，發生巰基與二硫鍵的交換，而α-La隨著不斷地加熱也發生變性，乳清蛋白在低溫變性過程中α-La通過與β-Lg發生聚合間接與酪蛋白膠束結合，形成可溶性聚合物[7]。

近年來一些專家主要針對溫度、p H[8-9]等對乳清蛋白變性的影響做了深入探討，而酪蛋白作為乳中重要基質也對乳清蛋白的變性有一定作用，了解在低溫下酪蛋白對乳清蛋白的影響可以在不同時間、溫度下調節酪蛋白與乳清蛋白組間的熱誘導聚合作用，朝著有利于乳粉加工特性的方向發展。新鮮牛乳在35℃左右離心去除脂肪得到脫脂乳。而將脫脂乳中酪蛋白沉淀離心后進行調酸調堿得到乳清上清液。將兩種體系在一定條件下進行對比能夠突出酪蛋白對乳清蛋白變性的作用。以往研究的樣品多為脫脂乳、乳粉[10-11]等對比研究如此得到的檢測結果不能完全反應乳清蛋白熱變性及酪蛋白與乳清蛋白聚合情況。本研究以新鮮脫脂牛乳為基礎實驗材料，采用反相高效液相色譜法定量檢測加熱脫脂乳體系與乳清體系中未變性BSA、α-La、β-Lg的含量，通過探究乳清蛋白組間的相關性，了解低熱脫脂乳粉關鍵溫度的控制范圍，研究乳清蛋白熱變性趨勢及酪蛋白對乳清蛋白變性影響大小，以及為乳粉的生產和使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛奶（購于天津奶廠），預先離心除脂，5℃冷藏備用；三氟乙酸（色譜純 天津賽孚瑞科技有限公司）；乙腈（色譜純博歐特（天津）化工貿易有限公司）；超純水。

1.2 儀器與設備

AB204-N電子天平上海METTLER TOLEDO集團；HWS24型電熱恒溫水浴鍋上海-恒科學儀器有限公司；TDZ5-WS離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；FE20Mettler pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；L2000高效液相色譜儀日本島津公司；色譜柱（Venusil ASB-C8（250 mm×4.6 mm，5μm，300?）。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫脂乳樣品的制備

將脫脂乳分裝在5個250 mL燒杯中分別水浴加熱到55、65、75、85、95℃。5個樣品在其對應加熱溫度下保持1、5、10、20、30 min，循環冰水浴中迅速自動冷卻，然后用0.1 mol/L的HCl溶液沉淀酪蛋白和變性的蛋白質，直至溶液pH值調節至4.6達到沉淀終點。經6 500 g離心，取上清液過0.22μm濾膜，制成待檢測樣品。

1.3.2 乳清上清液的制備

脫脂乳用1 mol/L的HCl將p H值調節至4.6，沉淀酪蛋白，經6 500 g離心30 min后取上清液，用1 mol的NaOH溶液調節p H值至6.6～6.7，再將收集的乳清上清液按照1.3.1方法進行加熱處理，檢測結果與加熱脫脂乳樣品進行對比。

1.3.3 液相檢測條件

液相條件：本實驗采用RP-HPLC法分離并測定未變性的乳清蛋白的含量，實驗用色譜柱為Venusil ASB-C8（250 mm×4.6 mm，5μm，300?）；流速為0.8 mL/min；進樣量為10μL；檢測波長為215 nm；柱溫30℃；洗脫時間25 min；流動相A：0.1%的三氟乙酸水溶液；流動相B：0.1%的三氟乙酸乙腈溶液；采用梯度洗脫方式。

梯度洗脫：流動相B初始比例20%（流動相A為80%）在20 min內上升到80%（變化率為3%），然后在80%下等梯度洗脫6 min，最后1 min內降到20%，洗脫時間27 min。

1.3.4 BSA、α-La、β-Lg變性率的計算

根據所檢測的未加熱鮮脫脂奶和加熱脫脂奶中檢測到的蛋白含量，計算蛋白變性率。

蛋白變性率=（未加熱樣品中蛋白含量－加熱樣中蛋白含量）/未加熱樣中蛋白含量×100%

2 結果與分析

2.1 在乳清體系及脫脂乳體系中乳清蛋白主要組分對乳清蛋白熱變性的影響

通過RP-HPLC方法分析脫脂乳在不同加熱溫度和加熱時間下，乳清蛋白主要組分BSA、α-La、β-Lg的熱變性率，并與同樣處理的乳清體系中乳清蛋白的熱變性率做比較分析，以評估乳清蛋白主要組分對乳清蛋白熱變性的影響。

2.1.1 BSA對乳清蛋白熱變性的影響

圖1為不同加熱溫度（55～95℃）和不同加熱時間（1～30 min）下，脫脂乳體系和乳清體系BSA的變性率比較結果。

如圖1可得，在不同加熱條件下，脫脂乳體系與乳清體系中BSA熱變性趨勢大致相同，當溫度達到65℃時BSA變性顯著，伴隨著65～85℃加熱溫度的逐步升高，存在時間累積效應，即隨著加熱時間的增長，BSA變性率劇增，85～95℃幾乎迅速全部變性。主要由于在加熱溫度達到60℃或以上時，BSA分子結構中自由巰基的顯露致使BSA單體的穩定性減弱，分子結構打開生成聚合物[12]。BSA分子中的自由巰基能導致本身變化[13]，溫度的逐步升高使裸露的巰基發生巰基-二硫鍵的交換并且通過疏水作用本身產生聚合，最后生成凝膠。脫脂乳體系中酪蛋白幾乎不對乳清蛋白變性產生影響，而BSA本身一般不會與酪蛋白產生聚集反應。Kang等[14]人猜想BSA也許與蛋白質間分子動力學不符，即BSA持續保留著不完整體形態，聚集反應不明顯。BSA不僅可以利用本身聚集生成聚集物，而且能依靠二硫鍵與α-乳白蛋白生成少量可以溶解的聚集物。Hines等[15]人研究顯示，BSA的聚合量與β-Lg關系不大。由此BSA也不可能依靠α-乳白蛋白與β-乳鐵蛋白和酪蛋白生成不可溶解的聚集物，因此在含有一定乳清蛋白的牛乳狀態中，BSA的變性趨向不可能呈現明顯差別。

2.1.2 α-La對乳清蛋白熱變性的影響

圖1不同加熱溫度與加熱時間下，脫脂乳體系與乳清體系中BSA的變性率

圖2為不同加熱溫度（55～95℃）和不同加熱時間（1～30 min）下，脫脂乳體系和乳清體系中α-La的變性率比較結果。

從圖2可以看出65～95℃加熱溫度下，α-La的變性率隨加熱時間的延長而平穩增加。隨著溫度的不斷升高，α-La打開了分子內二硫鍵通過疏基二硫鍵交換反應產生聚集[16]。溫度低于75℃時，在加熱脫脂乳體系與乳清體系中的α-La變性率差異較小，而在75～95℃的加熱范圍內變性率區別明顯。α-La不含有游離巰基，不會出現自聚合反應，在加熱溫度低于75℃時，脫脂乳體系與乳清體系中的α-La大部分都只發生空間結構變化，在此溫度之間，使得在乳清蛋白聚合中起主導作用的β-Lg沒有發生大量變性[17]，不能提供游離巰基，而BSA加熱后發生的自聚現象，使單體BSA的量降低[18]，α-乳白蛋白運用極小量的BSA供給的巰基與之發生聚合，但BSA自身含量較低，兩者生成的復合物含量低微，聚合度不大，幾乎不與酪蛋白聚合。加熱溫度高于75℃，特別是85℃左右時，脫脂乳體系與乳清體系中的α-乳白蛋白變性率差異趨于顯著，或許是脫脂乳體系中β-乳鐵蛋白的球狀蛋白結構破壞失去穩定，α-乳白蛋白利用β-乳鐵蛋白游離出的巰基參加與酪蛋白膠束的反應，α-乳白蛋白與酪蛋白聚集量逐漸增多，結合的α-La-β-Lg也與酪蛋白聚集，因而使α-La變性速度增快。95℃時脫脂乳體系與乳清體系中α-乳白蛋白變性率差異較小，乳清體系中原來被保存下來的α-乳白蛋白由于加熱溫度較高，加熱時間太長而全都發生變性，并與乳清蛋白中的其它蛋白組分產成聚集物。

圖2不同加熱溫度與加熱時間下，脫脂乳體系與乳清體系中α-La的變性率

2.1.3 β-Lg對乳清蛋白熱變性的影響

圖3為不同加熱溫度（55～95℃）和不同加熱時間（1～30 min）下，脫脂乳體系和乳清體系中β-Lg的變性率比較結果。

由圖3可以看出，在加熱溫度為75～85℃時，脫脂乳體系與乳清體系中的β-Lg變性程度有明顯差別。溫度升高，β-Lg空間構象產生變化，巰基發生暴露，聚合量逐漸增多，但因酪蛋白的結構穩定，自身很難發生變性[19]。當溫度達到80℃以上時，β-Lg變性率激增，脫脂乳體系中酪蛋白產生解離，覆蓋在酪蛋白膠束表面的κ-CN會與己變性的β-Lg產生反應。對脫脂牛奶進行加熱過程中，β-Lg的兩個二硫鍵和一個巰基在與κ-CN反應中起到重要作用，κ-CN分子中含有2個巰基（-SH），受熱形成二硫鍵（-S-S-），與變性的β-Lg分子中游離巰基發生分子間巰基-二硫鍵反應，形成κ-CN/β-Lg復合物質凝聚在酪蛋白膠束表面[20]，同時在加熱溫度不斷升高的情況下不止是通過改變分子的結構產生聚合反應，也可能是分子間的無規則布朗運動加劇，分子間的碰撞提高而促進聚合物的生成[21]。在脫脂奶中還有一些含量較低的乳鐵蛋白和αs2-酪蛋白中含有的二硫鍵也可以與巰基產生交互作用形成熱誘導聚集體[22]。

乳清體系中缺少酪蛋白，當加熱溫度低于75℃時，乳清蛋白變性率較低，其自身不會產生很大程度變性，85℃脫脂乳中部分變性的β-Lg與κ-酪蛋白聚合，在較高的溫度下蛋白分子間疏水相互作用的增加也進一步促進反應向蛋白變性的方向進行[23]。由于加熱溫度的持續升高，乳清蛋白組分間產生的游離巰基繼續促進變性蛋白通過巰基-二硫鍵交換聚合·成高聚物，直到最后β-Lg實現完全變性。

在β-Lg變性過程中，乳清體系中產生的鹽離子也可能影響β-Lg的變性程度。鹽離子濃度的增加使蛋白質的電荷分布發生變化，β-乳球蛋白以非共價鍵的形式存在且形成的聚合物一般為低聚體[24]。NaCI具有鹽析作用，當鹽離子濃度較高時，它能夠穩定蛋白質的空間構象，使β-Lg的變性速率減慢。高濃度鹽離子還能夠加快蛋白的聚合。當鹽離子濃度較低時，蛋白的表面特性發生改變，物理化學聚集速度提高，聚集物增大[25-26]。Nicorescu[27]發現在WPI溶液中加入NaCI溶液，有利于蛋白質單體和二聚體的鹽析聚集，促進可溶性聚合物含量增加，乳清蛋白溶液的表面張力降低。Aymard[28]等研究發現在鹽離子濃度增大的過程中，β-乳球蛋白中單體和二聚體失去了平衡，二聚體含量逐步增多。由此推測出由于加入的鹽離子使蛋白分子產生靜電排斥，所帶電荷進行重新分布。所以鹽離子濃度可能會影響β-乳球蛋白的聚集程度，進而影響變性速率。

從脫脂乳體系與乳清體系中3種蛋白熱變性率對比趨勢圖能夠得出，酪蛋白對BSA熱變性影響不大，而一定程度上在65～95℃之間促進了α-La和β-Lg的熱變性，但蛋白的最終變性趨勢相同，即趨向全部變性。因此酪蛋白的缺失不會對乳清蛋白的最終變性產生很大影響，只是減緩了乳清蛋白的聚合速度，并沒有使乳清蛋白在95℃加熱下的最終變性程度下降。

圖3不同加熱溫度與加熱時間下，脫脂乳體系與乳清體系中β-Lg的變性率

3 結 論

對比乳清體系與脫脂乳體系中BSA、α-La和β-Lg的熱變性情況分析顯示BSA在脫脂乳體系與乳清體系中變性趨勢基本相同，α-La的變性率在75～95℃的加熱范圍內呈現一定差量，而β-Lg在75～85℃加熱范圍內變性率有明顯差異。

3種蛋白的熱變性率具有明顯的溫度與時間累積效應，BSA的熱變性激增區間為55～85℃，β-Lg為65～75℃，而α-La的熱變性率則在65～95℃間隨加熱時間和加熱溫度的升高而平穩增加，三種蛋白熱穩定性大小順序為：α-La＞β-Lg＞BSA。乳清體系中產生的鹽離子在一定程度能夠增強溶液中的離子強度，對β-乳球蛋白的變性可能會產生一定影響。

通過對兩種體系中BSA、α-La和β-Lg的熱變性比較表明酪蛋白對BSA的熱變性幾乎沒有影響，而對65～95℃間α-La和β-Lg的熱變性有一定的促進作用，能夠加速乳清蛋白之間的誘導聚合反應。缺乏酪蛋白，乳清蛋白的聚合速度減緩，而95℃的最終變性率基本相同。

本文對脫脂乳體系和乳清體系中的乳清蛋白主要組分在不同條件下進行了比較分析，在低溫下了解了乳清蛋白主要組分的變性情況，而在高溫狀態下兩種體系中乳清蛋白主要組分的變化需進一步研究。在實際生產中的壓力、p H、離子強度等因素也可能會影響蛋白變性情況，需要更深入進行全面系統研究。進一步了解脫脂乳體系和乳清體系中的蛋白變性情況更有利于實際生產中的加工運用。