新疆畜間布病分子流行病學特征分析

馬曉菁，葉 鋒，劉麗婭，劉 帥，謝彩云，谷文喜，鐘 旗，馬俊杰，易新萍

(新疆畜牧科學院獸醫研究所，烏魯木齊 830013)

0 引 言

【研究意義】布魯菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯菌(Brucella)引起的一種嚴重危害畜牧業生產和人類公共衛生安全的人畜共患病[1]。新疆是我國五大牧業基地之一，畜牧業在國民生產總值中占有非常重要地位，主要以布魯菌病屬的羊種菌和牛種菌為優勢菌種的農、牧區型和城市型布病老疫區[2]。近年來， 隨著家畜規?；B殖的興起和牲畜流動的加快，畜間布病發病率呈明顯上升趨勢，人間布病的發病數也逐年遞增[3]。由于帶菌動物是其他動物和人類布病的主要傳染源，因此，從源頭遏制畜間布病疫情上升趨勢是控制人間布病的重要前提。多位點可變數目串聯重復序列分析(multiple locus variable number tandem repeat analysis，MLVA)是近年發展起來的以PCR為基礎，根據被檢菌株散在基因組中不同位點的、變數量串聯重復序列( variable number tandem repeat，VNTR)的重復單元拷貝數的差異進行分子分型的技術[4]?！厩叭搜芯窟M展】多位點可變數目串聯重復序列分析(MLVA)技術具有高分辨率優勢的多態性遺傳標記，在評價疫苗效果、種系間遺傳與進化以及疾病爆發的追蹤等方面起著重要作用。MLVA技術在布魯菌分型上應用較為廣泛，2003年Bricker等[5]將高變量八聚物寡核苷酸指紋技術(HOOF-Prints)應用到布魯菌的菌型鑒定中。隨著MLVA分型技術迅速發展，對VNTR位點的選擇也相對多樣化，根據VNTR數目的不同衍生出MLVA-15、MLVA-16、MLVA-17和MLVA-21等多種方案[6-7]。Marianne等[8]用MLVA-16對海洋哺乳動物布魯菌株分型，海洋動物布魯菌與陸地動物布魯菌存在差異，主要分為3個生物型。近年來，在我國利用MLVA技術對不同地區分離布魯菌進行分型鑒定以及遺傳關系比較研究，用于追溯傳染源，確定流行趨勢。楊杰等[9]初步建立我國布魯菌MLVA-16分型方法。毛玲玲等[10]采用MLVA-16對遼寧地區人間分離33株布魯菌分型，研究結果表明，該地區布魯菌流行菌株存在豐富的基因多態性。任曉麗[11]等對1株新疆分離綿羊附睪種布魯菌MLVA-16方法結合常規生物學方法分析，結果顯示兩種分型方法種屬結果一致?！颈狙芯壳腥朦c】為掌握新疆畜間布病流行病學特征，研究通過多重PCR方法和MLVA技術[12-14]對新疆2010-2015年分離的布魯菌進行基因分型研究?！緮M解決的關鍵問題】分析新疆畜間布病的流行特征及菌型基因特征情況，為新疆制定布病綜合性防控措施提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

對照標準菌株A19、M5和牛種3型布魯菌的DNA、牛羊布魯菌分離株均由新疆畜牧科學院獸醫研究所布病組保存。

布氏瓊脂和肉湯培養基(美國BD公司)。PCR相關分子生物學試劑和細菌核酸提取試劑盒(北京全氏金生物技術有限公司)。PCR引物由上海英俊生物工程有限公司合成，PCR產物由北京鼎國生物工程有限公司測序。

1.2 方 法

1.2.1 AMOS-PCR法鑒定布魯菌種/型

參照參考文獻[15-16]中的AMOS-PCR方法及參數對新疆布魯菌分離株進行布魯菌種/型的鑒定。

1.2.2 布魯菌MLVA分子分型

采用MLVA-16(16位點可變數目串連重復序列)分型方法，引物序列、擴增體系及反應條件見文獻[17]。16個引物分為2組：panel 1( Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce42、Bruce43、Bruce45、Bruce55 ),panel2A ( Bruce04、Bruce07、Bruce09 ) ，panel 2B ( Bruce16、Bruce18、Bruce19、Bruce21、Bruce30) 。MLVA反應體系為25 μL：2×TaqPCR mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板DNA1.0 μL，ddH2O補至反應體系25.0 μL，擴增參數：95℃預變性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環，72℃ 5 min。Panel1的PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳，1.8%瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min。Panel 2的PCR產物采用毛細管電泳。其中panel 2引物上游5’端標記熒光素(FAM)進行PCR擴增，PCR產物由北京鼎國生物工程公司測序。

1.3 數據處理

將擴增所得的PCR產物通過BioNumerics數據統計轉化為各位點的重復單元。通過http://mlva.u-psud.fr/MLVAnet與數據庫進行比較，以確定分型。應用非加權配伍組平均法(UPGMA)進行聚類分析，將獲得的布魯菌分型與國際Brucella數據庫在線比較并進行遺傳進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 AMOS-PCR結果

研究表明，牛種布魯菌(1，2，4，3a型)擴增出498 bp的特異性片段，牛種布魯菌(3b，5，6，9型)擴增出1 700 bp的目的片段，羊種布魯菌(1，2，3型)擴增出731 bp的目的片段。新疆地區的30株布魯菌分離株有26株為羊種布魯菌，4株為牛種布魯菌。圖1

M：Marker(DL2000)；1：羊種布魯菌M5疫苗株；2：牛種布魯菌A19疫苗株；3：牛種9型布魯菌；4：陰性對照；5-34：布魯菌分離株

2.2 布魯菌株MLVA位點串聯重復數

將16個VNTR位點的重復序列進行PCR擴增，將擴增所得的PCR產物通過BioNumerics數據統計轉化為各位點的重復單元數。表1

表1 新疆布魯菌分離株MLVA位點串聯重復數Table 1 MLVA tandem reapeat of Brucella isolated in Xinjiang

2.3 新疆布魯菌MLVA-16聚類

MLVA-16分型方法中panel 1引物擴增結果顯示，30株布魯菌有26株為羊種布魯菌，4株為牛種布魯菌，結果與AMOS-PCR種/型分型結果一致。BioNumerics6.6軟件聚類分析表明，新疆地區30株布魯菌可被分為10大基因群(A～J群)22個基因型。其中A群包含4個基因型4株菌，均與牛種布魯菌群聚為一簇。B～J群均與羊種布魯菌聚為一簇，其中B群、C群、D群及F群均為獨立基因型6株菌。E群包含3個基因型3株菌，G群包含4個基因型8株菌，H群包含2個基因型2株菌，I群包含2個基因型4株菌，J群包含3個基因型5株菌。圖2

圖2 新疆30株布魯菌分離株的MLVA-16聚類Fig.2 Dendrogram based on the MLVA-16 genotyping assay of the 30 Brucella strains in xinjiang

3 討 論

分離病原是確診布病的金標準，而對病原的種型鑒定是控制、預防和根除布病的重要環節。布魯菌傳統的細菌學鑒定方法雖可以對病畜做出確切的診斷， 但鑒定耗時，操作步驟繁瑣，且對實驗室操作人員具有較高的感染風險。MLVA分子分型方法具有快速、操作簡單、重復性好等優點,且便于實驗室間的比較，可以作為傳統表型鑒定方法的補充[18-19]。研究中應用MLVA-16分型方法對新疆2010～2015年間21個縣/市分離的30株布魯菌從種、型、株水平進行鑒定，對菌株間的親緣關系開展分析研究，掌握了新疆畜間布病傳染源分布和疫情流行特征，為新疆制定布病綜合性防控方案提供前期基礎。

截止1990年，新疆從人體內分出的布魯菌主要以牛種菌占優勢[20]。全國近年的布病病原學監測結果表明，羊種3型布魯菌是我國人間布病的主要流行菌型，其次是牛種菌[10、21-22]。研究中MLVA-16聚類分析顯示，4株牛種布菌有3株在panel 1的8個位點均為4-5-3-12-2-2-3-1，并有2株panel 2A的3個位點 (Bruce18、Bruce19、Bruce21)也全部一致(6-21-8)；panel 1的4-5-3-12-2-2-3-1為牛種布魯菌的主要感染病原菌。與國內牛種布魯菌(重慶、黑龍江、河北、內蒙古)相比，新疆牛種布魯菌為獨立基因型，推測新疆是牛種布魯菌自然疫源地。盡管國內分離的90%布魯菌均屬于羊種布魯菌，但不同地域的基因型也存在一定差異。中國南方(浙江、云南、福建省)與北方(山西、內蒙古、遼寧、河北、山東、陜西)的布魯菌明顯屬于兩個獨立基因群。新疆26株羊種布魯菌中只有WS2株與山東分離株聚為一群(B群)，其他25株羊種菌均屬于獨立的基因型，即8個基因群(C～J群)17個基因型，新疆地區目前流行的布魯菌存在豐富的基因多態性。24株羊種布魯菌在panel 1的8個位點均為42型(1-5-3-13-2-2-3-2)，屬東地中海型；panel 2A的3個位點 (Bruce18、Bruce19、Bruce21)也全部一致，均為4-20-8 型。在panel 2B的5個位點(Bruce04、07、09、16、30)中，Bruce04、Bruce07、Bruce09也有13株是完全相同的，均為4-4-3型；有4株菌的panel 2B的5個位點完全相同4-4-3-6-5(為G型)，羊種布魯菌在時間和區域上的感染源是相關聯的。G群基因型( 30.77% ) 為新疆目前主要的流行基因型。布魯菌MLVA-16聚類分析表明，新疆畜間布魯菌感染的主要流行病原菌為羊種42型，屬于東地中海型。

布魯菌的各型菌有其主要的感染宿主，但也能轉移于其它宿主，各型布魯菌在不同種動物間有跨物種間傳播現象[23]。從基因型多態性來看，研究中分離的7株羊種菌的宿主來源于牛，但其廣泛分布于5個基因群的6個基因型中。從菌株分離地點分析，阿勒泰地區分離的8株布魯菌廣泛分布于6個基因群的8個基因型中，菌株之間的親緣關系較遠。南疆和北疆地區分離的布魯菌可聚類在相同基因型中(CBC1、HT1)，以上結果表明新疆分離到的布魯菌株顯示出豐富的基因多態性現象。綜上所述，近幾年新疆人間布病疫情明顯呈現擴大蔓延之勢，主要與畜牧養殖生產活動有關。一方面，疆內外牲畜養殖量大規模發展與牲畜交易日益頻繁是導致布病疫情上升的一個主要原因。 另一方面，牲畜檢疫、免疫及無序移動的監管無保障。眾所周知，在不同的國家和地區，以至在一個國家的不同地方，各種動物作為傳染源的意義不盡相同[24]。

4 結 論

30株布魯菌中4株為牛種布魯菌，26株為羊種布魯菌。MLVA-16聚類分析結果表明，新疆地區30株布魯菌可被分為10大基因群(A～J群)22個基因型，新疆地區流行的布魯菌存在豐富的基因多態性。 MLVA -16方法對布魯菌種、生物型和菌株間差異有很高的鑒別力。