細菌脂蛋白生物合成調控研究進展

賈雨晴 夏杰 張文軒 聞剛 馮波 連旭 薛文杰 吳松

(中國醫學科學院，北京協和醫學院藥物研究所，活性物質發現與適藥化研究北京市重點實驗室，北京 100050)

細菌脂蛋白是一種脂質修飾的膜蛋白，是革蘭陰性菌外膜和革蘭陽性菌細胞被膜的重要組成成分[1]。脂蛋白在細菌的重要生理過程中如細胞膜的合成，營養攝取，細胞壁代謝，細胞分裂，跨膜信號轉導，孢子形成，抗生素耐藥性，物質轉運(如ABC轉運系統)以及蛋白質的胞質外折疊[2]發揮關鍵作用，對細菌的生存至關重要。對于病原菌來說，脂蛋白既是細菌在復雜環境中生存的基礎，也常常是其致病不可或缺的毒力因子，直接參與病原菌的多種致病機制，如細菌定殖、入侵、逃避宿主防御和影響宿主免疫系統等[3-5]。脂蛋白基因普遍分布在細菌中，占細菌總基因組的1%～3%[6]。盡管細菌脂蛋白具有不同的來源、結構和功能，但均具有Leu-(Ala/Ser)-(Gly/Ala)-Cys組成的稱為“lipobox”的共識序列[7]。脂蛋白以前體形式在細胞質中合成，通過Sec或Tat分泌系統首先被轉運到細胞內膜的外表面上，然后進行脂蛋白的生物合成[8-9]。脂蛋白的經典生物合成途徑包括以下步驟(圖1)：首先，二酰甘油基轉移酶(Lgt)識別原前脂蛋白保守序列中的半胱氨酸Cys，將磷脂酰甘油醇(PG)的二酰甘油基轉移至半胱氨酸的巰基上，形成二酰甘油基修飾的前脂蛋白。然后，脂蛋白信號肽酶Ⅱ(LspA)切除二酰甘油基-前脂蛋白的信號肽形成脂蛋白。最后，脂蛋白N-?；D移酶(Lnt)催化磷脂酰乙醇胺(PE)的?；溵D移到半胱氨酸的N末端，產生一個成熟的三?；鞍譡10]。其中Lgt和LspA存在于所有革蘭陰性和革蘭陽性細菌中，而Lnt僅存在于革蘭陰性菌和高GC(鳥嘌呤、胞嘧啶)含量的革蘭陽性菌中。在低GC含量的革蘭陽性菌中，脂蛋白多以二酰甘油基脂蛋白的形式存在，但仍有一些細菌中存在非經典生物合成途徑，如枯草桿菌和金黃色葡萄球菌中，脂蛋白以三?；鞍仔问酱嬖赱11-12]。正確的脂蛋白修飾以及該過程中所涉及到的酶對革蘭陰性菌和一些高GC含量的革蘭陽性菌的活力至關重要。了解這些酶的催化機制，結構和功能有助于發現針對這一重要途徑的新型抗生素。因此，本文中主要介紹了這3種酶的生物學功能和晶體結構。

1 前脂蛋白二酰甘油基轉移酶Lgt

Lgt催化脂蛋白產生路徑的第一步反應，能夠識別前脂蛋白“lipobox”的共識序列[LVI]-3[ASTVI][GAS]C+1，從而將來自磷脂酰甘油醇(PG)的二酰甘油基轉移至lipobox序列中半胱氨酸殘基的巰基上[13]，形成二酰甘油基修飾的前脂蛋白。Lgt位于細胞內膜中，是由lgt基因編碼形成的含有291個氨基酸(33kDa)的膜蛋白[14]，其最適反應溫度為37℃，最適反應pH為7.8[15]。大多數細菌含有一個單一的lgt基因，只有少數細菌有兩個或兩個以上的lgt同源基因[16]。Lgt對底物的識別具有特異性[17]，帶負電荷的磷脂酰甘油醇(PG)是最有效的二酰甘油基供體；另外兩種帶負電荷的磷脂酸(PA)和磷脂酰絲氨酸(PS)可作為低效的供體；中性磷脂，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰膽堿(PC)和二酰甘油基(DAG不能作為Lgt的底物)。最近對保守氨基酸殘基的分析，表明了Lgt特征序列的存在，并且該序列中的兩個氨基酸殘基(Asn146和Gly154)對于Lgt的功能是必不可少的[18]。另外，氨基酸殘基His103-Gly108以及Tyr26和Tyr235對于Lgt的功能也很重要[19]。Lgt功能的缺失，會導致革蘭陰性菌死亡，可能是由外膜脂蛋白的基本特性決定的[20]，如Yfio外膜蛋白是大腸埃希菌存活的必要組分。Lgt對于所有革蘭陽性細菌的體外生長是非必要的，可能是某些前體脂蛋白具有與必需脂蛋白相同的功能[21-22]，例如PrsA脂蛋白是枯草芽孢桿菌中的必需蛋白質，但該生物體的lgt突變體仍然能夠存活。但是Lgt功能的缺失會導致革蘭陽性菌活力和致病能力的下降，例如枯草芽孢桿菌lgt突變體在細胞色素caa3活性[23]，蛋白質分泌[22]，孢子形成[24]中表現出可與特定脂蛋白功能受損相關的缺陷。因此，Lgt是研發新一代廣譜型抗生素的潛在靶標。2016年，Zhang課題組[10]解析出大腸埃希菌Lgt的蛋白結構(圖2)，并確定了具有催化作用的氨基酸殘基。Lgt由7個跨膜螺旋(TM)組成，其N末端朝向細胞周質，C末端朝向細胞質，構成了蛋白結構的主體，此外，還有6個β-片層和4個α短螺旋。在跨膜螺旋TM4和TM5之間，4個扭曲的β片層(β1、β2、β4和β6)和2個α短螺旋(α3和α4)形成1個具有球形形狀的周質頭部結構域。此外，Lgt有兩條兩親性臂，一條是由跨膜螺旋TM1的N-末端β片層(β2和β3)形成的“臂-1”，一條位于TM2和TM3之間，由α1和η2(20個氨基酸殘基組成的短鏈)形成的“臂2”?？缒ぢ菪齌M2、TM3和“臂2”形成了一個小的跨膜結構域，其余的跨膜螺旋則形成了主要的跨膜結構域。對于Lgt功能很重要的氨基酸殘基His103-Gly108位于跨膜螺旋TM3的N-末端。在兩個跨膜結構域之間有一個中心腔，該腔內有兩個底物結合位點，第一個結合位點是Glu151，第二個結合位點是Arg143，該腔的底部(細胞質側)是完全疏水的，而上部(細胞周質側)由更多極性氨基酸殘基組成，與底物PG的分布取向一致。此外該中心腔有兩個(正面和側面)裂隙作為底物PG的潛在入口和釋放離去基團的周質出口。具有催化活性的氨基酸殘基Arg143和Arg239也位于該中心腔中，其對二酰甘油基的轉移至關重要。前脂蛋白的巰基可能對磷脂酰甘油醇的羰基進行親核進攻，其中Lgt提供催化殘基Arg143以支持二酰甘油基轉移到前體蛋白上，并將兩個底物靠近在一起，而Arg239通過與二酰甘油基(DAG)形成氫鍵，協同Arg143發揮作用。

圖1 脂蛋白產生途徑[10]Fig. 1 The canonical biosynthetic pathway of bacterial lipoproteins[10]

圖2 大腸埃希菌Lgt晶體結構[10]Fig. 2 Crystalstructure of E. coil Lgt[10]

2 脂蛋白信號肽酶II LspA

LspA作用于脂蛋白產生途徑的第二步，通過切除前脂蛋白上半胱氨酸N末端的信號肽，形成脂蛋白。LspA是由169個氨基酸組成的蛋白質，普遍存在于細菌中，位于細胞質膜上，其反應適宜溫度37～45℃，最適反應pH7.8[14]。盡管其缺少天冬氨酰蛋白酶的氨基酸共有序列Asp-Thr-Gly[25]，但是LspA被初步確定為天冬氨酰肽鏈內切酶。在革蘭陰性菌中，LspA嚴格切除脂質修飾的半胱氨酸殘基N-末端的信號肽，而一些革蘭陽性菌的LspA可能對底物具有較低的特異性或不同的識別模式，如鏈球菌的LspA已被證明可以切割原前脂蛋白中未經修飾的半胱氨酸殘基N末端的信號肽[26-27]。LspA是革蘭陰性菌中必需的酶。在革蘭陽性菌中，LspA是非必需的，可能是因為LspA突變菌株中前體脂蛋白的積聚導致其他肽酶的替代處理[28]，例如最近在糞腸球菌中發現了Eep肽酶，其參與了前體脂蛋白信號肽的切割過程。但LspA功能的缺失會導致革蘭陽性菌致病能力的減弱[29]，例如，金黃色葡萄球菌LspA突變菌株毒力減弱。大部分細菌有一個單一lspA基因，只有少數細菌擁有兩個同源性的lspA基因，并且LspA與已知結構的蛋白質沒有序列同源性，在人體中無同源類似物，使其成為潛在藥物靶點[30-33]。2016年，Caffery課題組[34]解析出銅綠假單胞菌LspA-Globomycin(格羅泊霉素)共晶結構，并確定了其催化位點。LspA由兩個結構域組成(圖3a)，第一個結構域由4個跨膜螺旋(MH1-4)組成，其N末端和C末端均在細胞質中。第二個是細胞周質結構域，它由兩個亞結構域所組成，其中較大的一個亞結構域是一個由4條肽鏈組成，兩親性的β-片層，位于細胞內膜上。第二個亞結構域由周質螺旋(PH)組成，也位于細胞內膜上，其長軸正交于β-片層。LspA-Globomycin共晶結構顯示，格羅泊霉素通過氫鍵以及疏水作用牢固的鑲嵌在LspA中，作用在跨膜螺旋MH1、MH2和MH3之間電子云密度獨特的環形區域，格羅泊霉素的Leu、Ile和Ser的主鏈羰基和LspA嚴格保守的氨基酸殘基Asn112和Arg116的側鏈形成氫鍵，而Leu的側鏈，羥基脂肪酸的乙?；溑cLspA非極性氨基酸殘基具有疏水相互作用。此外，格羅泊霉素Ser上的β-OH與LspA氨基酸殘基Asp143的羰基形成了最為顯著的氫鍵，Asp143是LspA催化二聯體中其中一個氨基酸殘基，另外一個是Asp124(圖3b)。LspA催化前體脂蛋白N-末端信號肽裂解的機制為：LspA的N端與二酰甘油基脂蛋白結合，起催化作用的天冬氨酸殘基Asp143、Asp124與水分子形成氫鍵來保持它所在的位置。當遇到二酰甘油基脂蛋白時，Asp143協助水分子進行親核進攻，Asp124則是活化二酰甘油基脂蛋白肽鍵的羰基碳，形成四面體中間體。羰基碳上酰胺鍵的斷裂重排，導致前體脂蛋白N末端信號肽的斷裂。另外，對來自485個與銅綠假單胞菌的LspA具有35%～95%序列同源性的生物體進行LspA氨基酸序列的推導，分析鑒定出LspA有14個嚴格保守的氨基酸殘基(Asp23、Lys27、Asn54、Gly56、Gly108、Ala109、Asn112、Arg116、Val122、Asp124、Phe139、Asn140、Ala142和Asp143)。

2.1 LspA抑制劑

2.1.1 格羅泊霉素(Globomycin)

1978年，格羅泊霉素(1)(圖4)首次被鑒定為由不同鏈霉菌菌株產生的對大腸埃希菌具有抑制活性的抗生素[35]。它是一個兩親性的19元環狀縮肽，由L-Ser和L-allo-Thr構成了極性的一半，而羥基脂肪酸，L-Leu和L-Ile構成了非極性的一半。動力學研究表明，格羅泊霉素以非競爭性抑制方式抑制LspA，其與二酰甘油基-前體脂蛋白的結合常數Ki為36nmol/L，米氏方程常數Km為6μmol/L[36]。其對LspA的EC50為2μg/mL[37]。格羅泊霉素對變形菌屬具有更好的抑制活性(但是對銅綠假單胞菌無活性)，對厚壁菌屬的抗菌活性較差[38-39]。對格羅泊霉素類似物的構效關系研究表明，隨著羥基脂肪酸烷基側鏈的延長，對革蘭陰性菌的抗菌活性也會隨之增強，可能是因為較長的側鏈可以增強其與LspA跨膜螺旋 MH2非極性表面的疏水相互作用。并且隨著烷基側鏈延長，其對一些革蘭陽性菌(鏈球菌，金黃色葡萄球菌，腸球菌)表現出一定的抑制活性。L-Ser的羥基對于格羅泊霉素發揮抑制作用是必不可少的[39]，可能是其與關鍵氨基酸Asp143形成了氫鍵相互作用，阻斷了LspA的催化活性位點。

2.1.2 Myxovirescin(TA)

圖3 LspA-Globomycin共晶結構[34]Fig. 3 LspA-globomycin complex structure[34]

抗生素TA(myxovirescin)(2)(圖4)是由黏細菌產生的次生代謝產物，具有28元大環內酰胺內酯結構，是一種快速殺菌劑，具有廣譜抗菌活性。TA已被證明可以靶向LspA發揮抑制作用[37]，對LspA的EC50為0.25μg/mL。TA對大腸埃希菌YX127的最低抑菌濃度為0.25μg/mL，而格羅泊霉素對大腸埃希菌YX127的最低抑菌濃度為2μg/mL，TA比格羅泊霉素顯示出更好的LspA抑制活性及抗菌活性。由于TA對真菌，原生動物，真核細胞，嚙齒動物甚至人類沒有毒性，其抗菌活性是特異性的[40]。但是TA具有代謝不穩定性，可將TA作為LspA抑制劑的先導物進行結構優化。

2.1.3 苯甲酰胺類化合物

2017年，Seiya等[41]報道了苯甲酰胺類化合物以非競爭性方式抑制LspA的活性，初始苗頭化合物3a(圖4)是通過高通量篩選得到的，該化合物包含苯甲酰胺基和噻二唑結構，對LspA的IC50為4.2μmol/L。通過對該化合物苯環上的甲氧基，噻二唑雜環，以及雜環上所連接的脂肪鏈進行結構修飾，得到了對LspA具有更強抑制作用的化合物3b，該化合物的IC50為99nmol/L?？赡苁怯捎诟锾m陰性菌的外膜滲透性限制了該化合物的有效性，化合物3b必須在細胞外膜穿透劑多黏菌素衍生物PMBN存在下，才能抑制大腸埃希菌的生長。在PMBN存在下，其對大腸埃希菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)為11μg/mL。此外，格羅泊霉素在PMBN存在下，對大腸埃希菌的抗菌活性增強了100倍。外膜滲透性是革蘭陰性抗生素藥物發現中的重要障礙，同時說明了體外LspA抑制作用和體內抗菌作用的差異。因此，LspA抑制劑和細胞外膜穿透劑或更多臨床相關的黏菌素或多黏菌素B的組合療法可能是增強LspA抑制劑體內和臨床有效性的方法。

3 脂蛋白N-?；D移酶Lnt

Lnt是作用于脂蛋白產生過程中的最后一個酶，催化磷脂酰乙醇胺(PE)的sn-1-?；溵D移到脂蛋白半胱氨酸游離的α-氨基上，最終形成成熟的三?；鞍譡42-43]，成熟的脂蛋白停留在內膜或被特定的脂蛋白轉運系統轉運到細胞外膜上，通過N端脂基團錨定在膜上發揮其正常功能。在革蘭陰性菌中，脂蛋白正確的細胞定位是其發揮正常生理功能的基礎，這依賴于細胞內脂蛋白轉運系統的正常運轉，Lnt對脂蛋白從細胞質膜釋放和通過脂蛋白轉運系統轉運到外膜是必不可少的。Lnt的缺失，會導致細胞質膜中脂蛋白的積累，這對革蘭陰性菌來說是致命的[44]。1991年，Gupta等[44]證實了大腸埃希菌Lnt位于細胞質膜上，并且確定了其最適反應pH(pH6.5～7.5)。2007年，Vidal-Vidal-Ingigliardi等[45]鑒定了Lnt的幾個主要的氨基酸殘基，它們主要位于起催化作用的周質結構區域，包括催化三聯體Glu267-Lys335-Cys387。該催化三聯體參與了兩步反應：在第一步反應中，Glu267充當反應過程的堿基，離去氫原子，活化Cys387，增強其親核性，進攻磷脂sn-1脂肪酸鏈上的羰基，形成硫酯-中間體；在第二步反應中，?；D移產生成熟的三?；鞍?，而Lys335用以穩定在N-?；磻獌蓚€步驟中形成的四面體中間體的含氧陰離子[46-47]。動力學研究顯示Lnt遵循乒乓(ping-pong)機制，由此在第一個反應中產生的溶血磷脂副產物，在第二個底物脂蛋白結合和修飾之前釋放[47]。Lnt對磷脂底物有選擇性，具有sn-1飽和脂肪酸鏈(棕櫚酸酯或油酸酯)和sn-2不飽和脂肪酸鏈的磷脂酰乙醇胺是其最有效的供體[47]。2009年，Tschumi等[48-49]首次報道了Lnt在高GC含量放線菌屬中的活性，恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌的Lnt直系同源物具有N-?；D移酶活性，出乎意料地是，恥垢分枝桿菌脂蛋白的N-?；舅岱N類和脂肪酸在磷脂中的位置分布表明[50]，其Lnt的底物應該來自PE的sn-2位置。這種特異性不同于大腸埃希菌Lnt底物來自PE的sn-1位置[51]，而對大腸埃希菌Lnt功能必需的氨基酸殘基Try237和Lys388，在恥垢分枝桿菌的Lnt中不存在[52]，這些氨基酸殘基被證明參與第二步的反應，載脂蛋白的N-?；?，表明它們可能在底物特異性中起作用[53]。在所有的鏈霉菌屬中，含有兩種lnt基因(lnt1和lnt2)，在疥瘡菌屬中，lnt1基因對于Lnt的N-?；D移功能至關重要，而lnt2基因對Lnt的功能不太重要，在lnt2基因不存在下，仍能產生成熟的三?；鞍譡54]。綜上，Lnt對于革蘭陰性菌和一些高GC含量放線菌屬的存活十分重要。因此，Lnt可作為廣譜抗生素的潛在靶標。2017年，Sharookn課題組[55]解析出野生型大腸埃希菌Lnt蛋白結構(圖5)，其由八條跨膜螺旋組成，N末端和C末端均位于細胞質中。TM3在氨基酸殘基Gly71中含有明顯的扭結，側鏈間的相互作用導致TM4和TM5具有相似的跨膜角度，TM4和TM5在內膜的外小葉附近稍微張開以形成通向Lnt周質結構域的溝槽。除了一個短的兩親性螺旋(Lys161-Gly168)在TM6之前靠在膜周質側，這些跨膜螺旋之間的大環(W141-V169)主要嵌入膜中。這些螺旋和介于它們之間的環形成一個小的親水性腔體。在跨膜螺旋TM7和8之間，具有一個大的特征性的α-β-β-α夾心折疊的周質碳-氮水解酶結構域，它由一個大的水解酶家族組成，包括腈基水解酶，酰胺水解酶，N-?；D移酶。其催化三聯體Glu267-Lys335-Cys387位于該水解酶區域。

圖4 LspA抑制劑(1、2、3a和3b)的結構Fig. 4 Structures of LspA inhibitors (1, 2, 3a and 3b)

圖5 野生型大腸埃希菌Lnt晶體結構[55]Fig. 5 Crystalstructure of wild-type Lnt[55]

4 結論與展望

隨著抗菌藥物的廣泛應用，細菌對抗生素產生了耐藥性，因此研發新作用機制的抗生素有望克服細菌耐藥性問題。脂蛋白生物合成途徑的Lgt和LspA，Lnt酶是原核生物特有的，干擾該合成途徑將影響大量脂蛋白的合成，因此脂蛋白的生物合成途徑所涉及的3種酶可以作為抗生素發展的潛在靶標。目前的臨床耐藥機制對作用于新靶標的抗生素可能不存在交叉耐藥性。此外，Lgt、LspA和Lnt這3種酶都是跨膜蛋白，這種結構可以使得一些小分子與它們結合，抑制它們的活性而不需要穿過難以滲透的細胞質膜，從而提高抗菌有效性。目前這3種酶的蛋白質晶體結構均已被解析出來，從而可以開展基于結構的藥物設計，加快抗耐藥菌藥物先導結構的發現。但是，目前針對脂蛋白的生物合成路徑所涉及的3種酶抑制劑，少有文獻報道。已報道的LspA抑制劑仍處于臨床前研究，其具體作用機理仍需進一步探究。