低氮源消耗和高產雷帕霉素菌株的選育

王欣榮 張雪霞 褚以文 鄭智慧 茍小軍 路新華

(抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，四川抗菌素工業研究所，成都 610052；2 華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，石家莊 050015)

雷帕霉素(rapamycin, RPM)是一種具有免疫抑制活性的大環內酯類抗生素。起初被作為低毒性的抗真菌藥物，1989年開始把雷帕霉素作為治療器官移植的排斥反應，是一種療效好、低毒、無腎毒性的新型免疫抑制劑[1]?？茖W家近期發現它另外一種用途：可用于治療阿爾茨海默癥(老年性癡呆)。目前雷帕霉素已被成功開發為新型強效的免疫抑制劑，用于器官移植抗排斥反應；以及新型包衣涂層藥物，用于涂層支架，防止心血管再狹窄；以雷帕霉素為基本結構單元進行衍生物的藥物合成研究，使該類藥物在抗腫瘤領域已有多個藥物上市[2-3]。但由于發酵水平低、生產成本高，很多患者在經濟上無法接受，因而，其推廣應用受到了一定的限制。

通過物理或化學的條件進行隨機的誘變是改良菌株的經典方法，雖然有效但通常需要耗費大量的時間和資源?！昂颂求w工程”是由日本國家食品研究所的Kozo教授[4]首先提出來核糖體工程(ribosome engineering)這一概念，它是以核糖體蛋白結構上的突變對微生物次級代謝調控作用的影響機制出發建立起來的微生物推理育種的新方法。常用于抗性篩選的抗生素有多種，其中以鏈霉素、利福平進行篩選的效果最佳[5-6]。

單菌多次級代謝產物(one strain many compounds,OSMAC)策略是通過改變培養基的營養成分、改變培養狀態、表觀遺傳調控及添加酶抑制劑等方法，充分挖掘微生物合成次級代謝產物的能力[7]。雷帕霉素產生菌包括吸水鏈霉菌和游動放線菌等，它們的共同特點是發酵培養基中含有大量的棉籽餅粉、黃豆餅粉和玉米漿等復雜氮源，帶來了巨大的環保壓力。

本研究以游動放線菌SIIA-1602作為出發菌株，首次將亞硝基胍、核糖體工程育種和常壓室溫等離子體方法結合，用于高產雷帕霉素菌株的選育，在篩選培養基中加入賴氨酸或哌可酸，以期篩選得到發酵水平有較大提高，氮源利用更加高效的新菌株，提高雷帕霉素的產量，以便降低生產成本，減少廢物排放，滿足市場需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

出發菌株：游動放線菌SIIA-1602(ActinoplanesSIIA-1602)，由本研究組保藏。

1.1.2 培養基及培養條件

平板及斜面培養基：葡萄糖，酵母提取物，可溶性淀粉，瓊脂等；pH自然。

種子培養基：葡萄糖，酵母提取物，可溶性淀粉，玉米漿，氯化鈉，CaCO3等，自來水配制，pH6.8～7.0。

發酵培養基：(1)對照配方(g/L)：葡萄糖40.0，淀粉20.0，棉籽餅粉10.0，玉米漿10.0，黃豆餅粉20.0，氯化鈉2.0，磷酸二氫鉀2.0，甘油4.0，豆油8.0，CaCO34.0，自來水配制，pH7.0～7.2，搖瓶裝液量25mL/250mL。

(2)配方1(g/L)：葡萄糖40.0，淀粉20.0，棉籽餅粉10.0，玉米漿5.0，黃豆餅粉4.0，氯化鈉2.0，賴氨酸8.0，磷酸二氫鉀2.0，甘油4.0，豆油8.0，CaCO34.0，自來水配制，pH7.0～7.2，搖瓶裝液量25mL/250mL。

(3)配方2(g/L)：葡萄糖40.0，淀粉20.0，棉籽餅粉7.0，玉米漿5.0，黃豆餅粉5.0，哌可酸1.0，氯化鈉2.0，磷酸二氫鉀2.0，甘油4.0，豆油8.0，CaCO34.0，自來水配制，pH7.0～7.2，搖瓶裝液量25mL/250mL。

1.1.3 試劑與儀器

試劑：鏈霉素購自Sigma公司；亞硝基胍，TCI；其余試劑均為國產分析純，雷帕霉素對照品購自美國藥典委員會。

儀器：立式蒸氣壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠； ARTP誘變育種儀，無錫源清天木生物科技有限公司；Agilent technologies 1200高效液相色譜儀、搖床(美國NBS)；10t微生物發酵罐系統(華北制藥工程裝備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

斜面及平板培養方法：無菌環取菌種涂布于培養基上，培養溫度28℃，培養9～12d。

種子培養方法：從活化的菌種斜面上挑取一環菌體接種至種子培養基中，培養溫度28℃，搖床轉速220r/min，培養80h。

搖瓶發酵方法：將培養80h的種子以6%接種量接入發酵培養基，培養溫度28℃，搖床轉速220r/min，培養168h。

10t發酵罐發酵方法：將培養60h的種子液(培養基以搖瓶發酵培養基的基礎上，添加0.05%的泡敵)以5%接種量接入發酵罐(發酵培養基在搖瓶發酵培養基的基礎上，添加0.05%的泡敵)，發酵罐裝液量為7000L，培養溫度28℃，攪拌速度120r/min，通氣量為7000L/min，培養周期6～8d。

1.2.2 菌懸液的制備

取新鮮斜面1支，加入滅菌的0.85%生理鹽水10mL，用竹簽刮下菌絲，制成菌懸液，玻璃珠30min，220r/min打碎，過濾，收集菌懸液，控制濃度為107CFU/mL。

1.2.3 NTG誘變

NTG用丙酮溶解，配制成濃度為10mg/mL。取1mL單孢子懸液，加入NTG母液，使終濃度分別為0.05和0.1mg/mL，震蕩處理時間為25、50和75min，加入硫代硫酸鈉終止反應，將經誘變處理的菌懸液稀釋并涂布到平板培養基上，于28℃培養11d，計算致死率，并挑選單菌落斜面培養后采用3種發酵培養基進行初篩，高產菌株自然分離后進行復篩。

1.2.4 鏈霉素抗性誘變

以NTG高產突變株為出發菌株，將新鮮菌懸浮液涂布于鏈霉素濃度30～150mg/mL的平板培養基上，28℃培養11d， 觀察生長情況，統計死亡率；挑取不同劑量下存活菌落繼續培養11d，進行搖瓶發酵檢測，考察菌種的突變傾向，確定最適篩選壓力。在較適鏈霉素抗性篩選壓力下篩選抗性菌株，斜面培養后采用3種發酵培養基進行初篩，高產菌株自然分離后進行復篩。

1.2.5 ARTP誘變[8]

將經上級誘變篩得菌株的單孢子懸液涂布于待照射載片上，按照ARTP生物誘變育種機的操作流程，以氦氣為工作氣體，點樣量為10μL，風干時間20s，設定功率為120W，通氣量為10SLM，等離子體發射源與樣品間距離為2mm。處理時間為0、30、60、90、120、150和180s，將誘變處理后的孢子洗下，稀釋并涂布到固體平板培養基上，置于28℃培養11d，計算致死率，并挑選單菌落斜面培養后采用3種發酵培養基進行初篩，高產菌株自然分離后進行復篩。

1.2.6 遺傳穩定性的考察

將篩選出的高產菌株在斜面培養基上連續轉接5代，每代菌株轉接3種發酵培養基，檢測雷帕霉素的產量，并對各代菌株的雷帕霉素產量進行分析比較，檢驗菌株的遺傳性狀是否穩定。

1.2.7 雷帕霉素效價分析方法[9]

取發酵液3mL，加入丙酮7mL混勻，超聲處理30min，12000r/min離心，取上清液進行HPLC分析。色譜條件：C18(250mm×4.6mm, 5μm)色譜柱，流動相為甲醇:乙腈:水=60:25:30(V:V:V)，柱溫50℃，流速1.0 mL/min，檢測波長277nm，進樣量10μL。

1.2.8 氨基氮測定

準確吸取2.0mL濾液于250mL三角燒瓶中，加10mL純水及0.1%甲基紅指示劑2～3滴，加0.1mol/L HCl 1～2滴至紅色，用0.02mol/L NaOH回滴定至黃色，加18%甲醛4mL，搖勻，放置5min，加酚酞2～3滴，以0.02mol/L NaOH滴定，滴至微紅色為終點(顏色的變化順序：紅→黃→微紅)，記錄NaOH毫升數，根據所耗NaOH毫升數，查表即得氨基氮的含量。

2 結果

2.1 NTG誘變

在0.05和0.1mg/mL的誘變劑量下，累計處理75min，致死率均達到80%以上(表1)。經誘變處理后挑取的單菌落200株經3種培養基初篩，0.1mg/mL NTG誘變50min，正突變率最高為32%。選取30株正突變高于15%的菌株經復篩后得到突變菌株N-092，采用不加前體物質賴氨酸或哌可酸的發酵培養基，發酵效價達到486μg/mL，較SIIA-1602提高了23.0%；而采用刪減氮源添加前體物質賴氨酸或哌可酸的發酵培養基分別達到467和440μg/mL，較SIIA-1602分別提高了37.4%和57.1%。

2.2 鏈霉素抗性突變株選育

在鏈霉素30～150mg/mL范圍內觀察游動放線菌SIIA-1602的生長表現。菌落在30～50mg/mL劑量以內死亡率較??；在70～90mg/mL范圍內死亡率逐漸增大；120mg/mL以上菌落生長極微弱，僅有極個別針點狀菌落生長，不能確定是否是由于涂布不均勻或其它原因而存活，故而不進行篩選。

表1 NTG誘變致死率結果Tab. 1 The fatality rate curve of NTG mutagenesis

在鏈霉素50～90mg/mL的劑量范圍內，挑取不同菌型共120株在3種發酵培養基上培養，考察雷帕霉素發酵單位，統計突變率(發酵單位變化超過±10%視為發生突變)。實驗顯示鏈霉素抗性劑量達70mg/mL時正向突變較好。

選取25株正突變高于15%的菌株經復篩后得到突變菌株SN-187，采用不加前體物質賴氨酸或哌可酸的發酵培養基，發酵效價達到548μg/mL，較N-092提高了15.4%；而采用刪減氮源添加前體物質賴氨酸或哌可酸的發酵培養基分別達到562和522μg/mL，N-092分別提高了23.4%和19.5%。

2.3 ARTP誘變

菌株致死率與等離子照射時間呈正相關，ARTP處理90s，致死率為90%左右，處理時間為120s時，致死率達到100%)。經誘變處理后挑取的單菌落120株經3種發酵培養基初篩，ARTP處理90s，正突變率最高為33.6%。選取35株正突變率高于15%的菌株經復篩后得到突變菌株ASN-256，采用不加前體物質賴氨酸或哌可酸的發酵培養基，發酵效價達到615μg/mL，較SN-187提高了13.6%；而采用刪減氮源添加前體物質賴氨酸或哌可酸的發酵培養基分別達到706和697μg/mL，較SN-187分別提高了26.2%和34.0%。

2.4 高產菌株的遺傳穩定性實驗

將經過3輪誘變篩選出的高產菌株ASN-256在斜面培養基上連續轉接5代，其產孢速度基本一致；對照配方組、賴氨酸組和哌可酸組雷帕霉素的產量分別穩定在595～618、698～715和690～706mg/L，其結果見表2，表明該菌株的遺傳性能基本穩定。

2.5 10t發酵罐試驗結果

采用突變株ASN-256按照“1.2.1”項方法進行了10t發酵罐發酵研究，采用添加哌可酸的發酵培養基，分別在48和96h補加了哌可酸0.05%，其發酵過程中氨基氮和生物量變化曲線如圖1，其發酵單位達到1250mg/L，比搖瓶發酵水平進一步增加了78.6%。菌株SIIA-1602采用在對照配方的發酵過程中，氨基氮和生物量變化曲線如圖1，其發酵單位為439mg/L。在發酵過程中，哌可酸組的氨基氮水平和生物量約為對照組的50%和60%，放罐時由于菌絲開始自溶，對照組的氨基氮顯著增加，而哌可酸組也略有上升。由于哌可酸組發酵單位明顯提高，且最后一天單位漲幅減緩，可以考慮提前一天放罐，廢液中的氨氮排放將大幅降低。經放罐粗提，哌可酸組產生的菌渣量為345kg，約為對照組的50%。

表2 A-256的遺傳穩定性Tab. 2 The genetic stability of ASN-256

3 結論與討論

以游動放線菌SIIA-1602為出發菌株，采用NTG誘變得到突變株N-092，發酵水平提高23.0%，采用刪減氮源添加前體物質賴氨酸或哌可酸的發酵培養基則分別提高37.4%和57.1%；采用鏈霉素抗性誘變N-092，得到多株高產菌株，其中SN-187發酵水平較原出發菌株N-092提高15.4%，采用刪減氮源添加前體物質賴氨酸或哌可酸的發酵培養基分別提高23.4%和19.5%；采用ARTP育種誘變SN-187，得到多株高產菌株，其中ASN-256發酵水平較原出發菌株SN-187提高13.6%，采用刪減氮源添加前體物質賴氨酸或哌可酸的發酵培養基分別提高26.2%和34.0%。出發株游動放線菌SIIA-1602經過NTG誘變、鏈霉素抗性和ARTP誘變篩選得到的突變株ASN-256，其發酵水平提高了55.7%，發酵培養基刪減氮源添加了賴氨酸和哌可酸后，發酵水平提高分別107.6%和148.9%。

在10t發酵罐通過流加哌可酸，使菌種ASN-256發酵單位進一步提高到1250mg/L，是菌株SIIA-1602采用配方1的發酵水平的2.85倍。菌種ASN-256總氮源使用量減少50%，放罐時氨基氮排放僅為菌株SIIA-1602的一半，菌渣量也顯著降低。由于發酵單位大幅提高，提前一天放罐則可以減少菌絲自溶帶來的廢液氨氮增加，進一步降低發酵廢液的氨基氮水平，使氨氮保留于菌渣，通過其它方式處理。

誘變育種是最常用的有效育種手段，采用多種誘變劑誘變育種，進行積累誘變，大大增加了菌株的突變頻率。選擇氨基糖甙類抗生素作為篩選壓力，試圖獲得導致核糖體蛋白發生突變，同時又能夠激活菌種產抗能力的變異株。根據雷帕霉素的生物合成途徑研究可知，雷帕霉素由6個乙酸和7個丙酸單位組成聚酯環，合成起始單位為環外的環己烷，來源于莽草酸；環上的哌可酸來源于賴氨酸[10-11]。發酵培養基中復雜的有機氮源可以提供賴氨酸，但也造成了氮源的浪費，使培養基過于豐富，加大了后期發酵廢液的環保處理壓力。因此，采用化學結構導向的分子設計育種方法，結合OSMAC策略中改變營養成分的方法，通過改變篩選培養基，減少復雜氮源，加入賴氨酸或直接添加哌可酸，有可能篩選到直接利用哌可酸合成雷帕霉素的菌種，減少氮源的使用。根據目標產物的生物合成途徑，在誘變篩選發酵過程中添加前體作為篩選壓力，試圖解除和緩解產物合成的限速步驟，可以進一步快速獲得解除終產物反饋抑制突變株。本研究將抗性誘變應用于雷帕霉素生產菌株，結合NTG和ARTP誘變，結合OSMAC策略篩選得到具備鏈霉素抗性，氮源利用率顯著提高的高產菌株。該菌株在生產能力、氮源利用和傳代穩定性方面都獲得了明顯的改善和提高；發酵組分無明顯變化，對后續工藝未產生不利影響。

經過誘變得到的突變株ASN-256雷帕霉素產量大幅提升，其發酵廢液中氨基氮水平大幅降低，菌渣量也減少了50%，顯著減少了環保處理的費用，降低了生產成本。在環境污染問題日益突出的今天具有較大的意義，符合節能減排的社會需求。