淋球菌對大觀霉素耐藥機制的研究進展

孫思 劉蘭蘭 佟立峰 呂純芳 羅珍胄,* 陳紹椿 陳祥生

(1 深圳市南山區慢性病防治院，深圳 518000；2 中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所，南京 210042)

淋球菌(Neisseria gonorrhoeae, NG)是全球最常見的性病病原體之一，由其所致的淋病在全球范圍內流行。淋病能導致泌尿生殖系統化膿性臨床表現，如果未及時治療，將可能向組織入侵，導致睪丸炎、附睪炎、骨盆炎癥或輸卵管炎，造成女性不孕、異位妊娠、胎膜早破和男性不育等后遺癥；若全身性擴散，將導致關節炎、腱鞘炎或皮炎等。除此之外，淋病還將加大艾滋病毒感染風險[1]。

淋病的治療藥物是抗生素，但由于抗生素的濫用，加大了淋球菌對抗生素的選擇壓力，同時淋球菌之間易發生耐藥基因的水平轉移，由此導致淋球菌先后對磺胺類抗生素、青霉素、四環素、環丙沙星和氧氟沙星普遍耐藥，同時也對目前推薦治療藥物(頭孢曲松、頭孢克肟、大觀霉素)表現出敏感性下降的趨勢[1]。大觀霉素作為多數國家治療淋病的推薦藥物之一，在控制淋病的流行、預防淋病的后遺癥以及降低艾滋病感染風險等方面起到重要作用，但部分國家和地區已有報道對大觀霉素耐藥的淋球菌菌株。因此，研究淋球菌對大觀霉素的耐藥機制刻不容緩。

本文將從淋病的流行現狀、淋球菌的耐藥現狀、大觀霉素在目前淋病治療方案中的作用、淋球菌對大觀霉素耐藥機制等方面進行綜述。

1 淋病的流行現狀和淋球菌的耐藥現狀

1.1 淋病的流行現狀

2012年，世界衛生組織(World Health Organization,WHO)估計全世界每年有7800萬人感染淋病，其中西太平洋區域3520萬人、東南亞區域1140萬人、非洲區域1140萬人。另外，在醫療資源缺乏的區域，由于檢測手段的缺乏，病例報告的不完整，可能使其報告的病例數遠低于真實情況[2]。

淋病在美國是第二大常見性病，2017年美國報告病例數約為55.56萬，發病率為171.9/10萬，其中南部地區發病率最高，為194.0/10萬[3]。2017年，英國新發淋病患者數目超過44500例，并且大部分病患的年齡低于25歲[4]。韓國衛生和福利部估計韓國淋病的年發病率為100/10萬[5]。

在我國，1953年淋病早期患者已近絕跡，1960年基本上完成了晚期患者的普查普治，1964年已基本消失淋病[6]。但我國在1991—1999年淋病的發病率逐漸上升至最高峰，達到22.78/10萬，之后經過一系列有效的防治措施，淋病的發病率在1999—2006年總體呈現下降趨勢，只是在2004年出現一個小的發病高峰(17.34/10萬)[6]，發病率目前最低的年份是2012年(6.78/10萬)，近幾年的發病率變化不大。目前淋病的上報例數居于性病中的第二位，全國甲乙類法定傳染病報告發病數的第5位，2016年的上報例數是115024，發病率為8.36/10萬，2017年上報例數為138855，發病率為10.06/10萬[7]。

1.2 淋球菌的耐藥現狀

淋病在各國受到重視，不僅在于其發患者數之多，更在于淋球菌對治療藥物的耐藥性。迄今為止，淋球菌已先后對推薦用于治療淋病的抗生素(磺胺類抗生素、青霉素、四環素、環丙沙星、氧氟沙星)產生廣泛耐藥[1]。

其他各國(或地區)淋球菌耐藥監測結果顯示淋球菌對青霉素、四環素和環丙沙星的耐藥率非常之高，對阿奇霉素也表現出一定的耐藥性，同時對頭孢類抗生素、大觀霉素的敏感性近年來都有所下降。對PubMed近10年的文獻統計，其他各國(或地區)淋球菌對青霉素耐藥率范圍為0.8%～100%[5,8]，四環素耐藥率范圍為6%～100%[9-10]，環丙沙星耐藥率范圍為2%～100%[9-10]，阿奇霉素耐藥率范圍為0.17%～25%[11-12]，大觀霉素耐藥率范圍為0.6%～11.6%[13-14]，頭孢曲松的耐藥率范圍為0.4%～1.6%[15-16]，其低敏率范圍為1.1%～55.8%[17-18]。

我國各地區已發表的數據顯示，淋球菌對青霉素、四環素和環丙沙星的耐藥率非常之高，對阿奇霉素也表現出一定的耐藥性，同時對頭孢類抗生素、大觀霉素的敏感性近年來都有所下降。近7年國內文獻顯示，我國各地區淋球菌對青霉素的耐藥率范圍為51.16%～98.9%，產青霉素酶淋球菌(penicillinase-producingNeisseria gonorrhoeae, PPNG)的百分率范圍為13.73%～42.41%[19-22]；四環素耐藥率范圍為57.7%～100%，抗四環素淋球菌(tetracyclineresistantNeisseria gonorrhoeae, TRNG)百分率范圍為12.5%～66.84%[19,22-24]；環丙沙星耐藥率范圍為39.83%～100%，其高度耐藥率范圍為42%～52.3%[25-27]；阿奇霉素耐藥率范圍為3.1%～29.9%[28-29]；大觀霉素耐藥率范圍為0.13%～6.25%[30-31]；頭孢曲松耐藥率范圍為0.5%～4.2%，其低敏率范圍為1.85%～12.2%[32-33]。廣東、河南和貴州檢出多重耐藥的淋球菌[28,34-35]。

2 大觀霉素在淋病治療方案中的作用

大觀霉素作為氨基糖苷類抗生素，能與16S rRNA相互作用，從而在肽鏈延長的過程中，阻遏延伸因子(elongation factor G, EF-G)將肽基tRNA從A位催化轉運至P位，抑制蛋白的翻譯。簡而言之，大觀霉素結合細菌的30S核糖體亞基，從而抑制蛋白的翻譯，產生抑菌的作用[36]。

在20世紀40年代，青霉素是治療淋病的主要藥物，但到了20世紀60年代早期，淋球菌中出現了產青霉素酶淋球菌(penicillinase-producingNeisseria gonorrhoeae, PPNG)，而青霉素無法治愈罹患該種淋病的患者。在這種情況下，大觀霉素作為特效藥用于治療這些患者。之后，隨著PPNG的流行率超過5%，大觀霉素于1981年在駐韓美軍中開始作為一線藥物用于淋病治療[37]。

在大觀霉素作為特效藥用于淋病治療后的1967年，荷蘭首次報道了在青霉素敏感的淋球菌中出現了大觀霉素抗性。另外，1981年在菲律賓出現了同時耐青霉素和大觀霉素的淋球菌。同時，1983年在英國倫敦出現了許多耐大觀霉素淋球菌。并且，1985年駐韓美軍中大觀霉素治療淋病的臨床失敗率達到8.2%。隨后，全球范圍便不再推薦用于治療淋病的單一療法[37]。

目前，淋球菌對大觀霉素的耐藥，特別是高水平耐藥，在全球非常少見。但如果將其作為一線治療藥物治療淋病，可能會導致淋球菌對其耐藥率的升高。大觀霉素對口咽部淋病的治療效果不佳，使得其應用范圍小于頭孢類抗生素，特別是在男同性戀人群中，大觀霉素的有效率更低。所以，許多國家和地區不將大觀霉素作為治療淋病首選抗生素，特別是不用于口咽部淋病的治療，但可用于頭孢類抗生素治療失敗的淋病患者的治療[38]。

各國或地區的淋病治療方案中，頭孢曲松是大多數國家所使用的首選治療藥物，但是，由于淋球菌對頭孢曲松的敏感性下降，特別是日本等出現對頭孢曲松耐藥的淋球菌，提示未來使用頭孢曲松治療淋病的嚴峻性[1]。大觀霉素雖然不作為治療淋病的首選藥物，但它在許多國家或地區的方案中，仍然作為一個替代治療藥物發揮作用。

韓國在2002—2006年，使用大觀霉素對大部分的淋病患者進行治療，并且2009—2012年的情況也與之類似。雖然韓國普遍使用大觀霉素治療淋病，但淋球菌對大觀霉素的敏感性依舊很高，目前大觀霉素在韓國作為推薦抗生素用于淋病的治療[5]。其他國家和地區淋病治療方案中大觀霉素的使用情況見表1。

3 淋球菌對大觀霉素耐藥機制

對于淋球菌，大觀霉素是一種外界刺激因子，當大觀霉素作用于淋球菌時，將導致淋球菌產生一系列的細胞反應，引起淋球菌對環境適應性的改變和蛋白表達水平的變化，這些變化也在一定程度上促進淋球菌對大觀霉素產生耐藥。淋球菌對大觀霉素耐藥的產生機制可以歸納為以下幾類：①抗生素的酶解或修飾；②靶標的修飾或保護，以降低其與抗生素的親和性[37]。

3.1 淋球菌對大觀霉素的反應

3.1.1 淋球菌對抗生素環境的適應性

一般而言，在有相應抗生素的體內和體外環境中，耐藥細菌相對于敏感細菌更有競爭優勢，而在沒有相應抗生素的環境中，耐藥細菌的適應性普遍比敏感細菌低。但是，耐藥淋球菌(resistantNeisseria gonorrhoeae, R-NG)相對于敏感淋球菌(spectinomycin sensitiveNeisseria gonorrhoeae, S-NG)，其適應性并不降低，原因在于mtrCDE外排泵操縱子的去阻遏作用[37]。

在一個BALB/c雌性小鼠下生殖道感染模型中，mtrD或mtrE的無效突變(null mutation)導致MtrCDE外排泵功能喪失，使得淋球菌持續感染的能力降低，這可能是由于細菌無法通過MtrCDE外排泵排出來源于宿主的疏水劑。此外，mtrR作為mtrCDE阻遏蛋白MtrR的基因，對它的無效突變將導致mtrCDE的過表達，從而使得R-NG在體內環境中的適應性提高。與之相反，對mtrA(mtrCDE的激活蛋白MtrA的基因)的無效突變，導致mtrCDE誘導性過表達的功能喪失，使得R-NG在體內環境中的適應性降低[45]。

表1 各國(地區)淋病治療方案中大觀霉素的使用情況Tab. 1 Application of spectinomycin for treatment of gonorrhea in different countries

另外，由于抗生素的廣泛使用，由此造成的選擇壓力使得某些R-NG相對于S-NG在體外和體內環境中具有更好的適應性。再者，細菌的補償突變、穩定突變和修復突變等特性能在保持其抗生素耐藥性的同時維持其在體內和體外環境的適應性。淋球菌的MtrCDE外排泵的功能和外界環境中抗生素的選擇壓力，使得青霉素、四環素、氟喹諾酮類藥物不用于治療淋病的多年之后，全球范圍內仍然有相當比例的相關R-NG流行[46]。

目前沒有發現淋球菌對大觀霉素的耐藥機制中包含了MtrCDE外排泵，所以自20世紀60年代用于淋病的治療以來，雖然出現了對大觀霉素耐藥的淋球菌，但在不推薦作為一線治療淋病藥物之后，淋球菌對大觀霉素的敏感性得到恢復。

3.1.2 大觀霉素引起淋球菌的蛋白表達水平變化

大觀霉素進入淋球菌胞質會破壞細胞膜的完整性[47]。Nabu等[36]對大觀霉素耐藥菌株(spectinomycin resistantNeisseria gonorrhoeae, SR-NG)和敏感菌株(spectinomycin sensitiveNeisseria gonorrhoeae, SS-NG)分別在無抗生素和低于大觀霉素最低抑菌濃度(subminimum-inhibitory-concentration, subMIC)的條件下所表達蛋白的水平進行比較，探索了大觀霉素和淋球菌相互作用時，淋球菌的蛋白組學圖譜。

研究發現，不管是SR-NG還是SS-NG，在subMIC的條件下，Rmp、DLDH、MQO、L7/L12、谷氨酸脫氫酶和過氧化物還原酶的表達均上升，氨基酸ABC轉運器底物結合蛋白(amino acid ATP binding cassette transporter substrate-binding protein,aa-SBP)的表達降低。Rmp屬于OmpA家族，是淋球菌主要的外膜蛋白組分之一，在淋球菌中起到維持細胞膜完整性的功能；DLDH和MQO參與了細菌的新陳代謝，它們表達的增高可能反應了淋球菌在不利于其生長的環境中為了維持其新陳代謝形成的適應性表現；谷氨酸脫氫酶和過氧化物還原酶參與細菌應對環境因素誘導產生的氧化應激的抵抗機制；L7/L12在蛋白合成以及EF-G功能實現的過程中發揮了重要的作用，其表達的上調可能是淋球菌為了克服蛋白合成抑制劑對翻譯抑制的補償機制；ABC轉運器作為大觀霉素進入的孔道，aa-SBP表達的減少，起到抑制大觀霉素進入細胞質的作用。而在無大觀霉素的情況下，SR-NG相對于SS-NG，其EF-Tu和EF-Ts的表達上調，起到促進蛋白翻譯的作用[36]。淋球菌對大觀霉素引起的蛋白表達的水平變化，在一定程度上反應了淋球菌對外界環境刺激因子的適應性變化。

3.2 藥物失活

近年研究發現，革蘭陰性菌中的腺苷轉移酶和磷酸轉移酶可使大觀霉素失活，從而導致細菌對大觀霉素耐藥。其中腺苷轉移酶有兩組，分別是ANT(3'')和ANT(9)。ANT(3'')是最常見的腺苷轉移酶，編碼它們的基因通常稱為aadA，目前至少有22種相關的基因，其以基因盒的形式嵌入整合子、質粒和轉座子，廣泛存在于革蘭陰性菌中；ANT(9)分為兩種，分別是ANT(9)-Ia和ANT(9)-Ib，編碼它們的基因也被稱為ant(9)-Ia和ant(9)-Ib，前者首先發現于金黃色葡萄球菌中，后者發現于糞腸球菌。磷酸轉移酶APH(9)目前發現有兩種，分別為APH(9)-Ⅰa和APH(9)-Ⅰb，前者發現嗜肺軍團菌，在氨基糖苷類抗生素中，只與大觀霉素結合[47]。

3.3 藥物作用靶點的改變

大觀霉素的作用靶點是16S rRNA，其34螺旋區域中C1192U的點突變會導致淋球菌對大觀霉素高水平的耐藥[48]。另外，30S核糖體蛋白S5的21～25位氨基酸形成的環形結構，能與16S rRNA的34螺旋區域結合，也參與到大觀霉素與核糖體的結合，該蛋白Val25的缺失和K26E的改變會導致淋球菌對大觀霉素高水平耐藥[49]，T24P的改變也會導致淋球菌對大觀霉素低水平耐藥[50]，可能是由于S5的改變擾亂了大觀霉素與16S rRNA的結合，導致淋球菌對大觀霉素耐藥。

4 展望

淋病作為常見性病之一，其病原體淋球菌所表現出的抗生素耐藥性一直被各國重視，并且各國政府和組織長期監測淋球菌對相關抗生素的耐藥率。對抗生素耐藥機制的研究，特別是對相關耐藥基因的研究，能優化耐藥監測的手段，指導精準治療，如檢測相關耐藥基因，相對于瓊脂糖稀釋法，能極大地縮短監測的時間和減少監測的成本，及早知曉耐藥情況，從而指導精準用藥，能在一定程度上緩解淋球菌對抗生素耐藥的嚴峻形勢。另外，闡明淋球菌對抗生素的耐藥機制，有助于針對性地開發新藥，同時指導藥物的聯合治療。淋球菌對大觀霉素的耐藥機制中不包括MtrCDE外排泵，對大觀霉素耐藥的淋球菌，在外界環境中其適應性相對于S-NG低。如果謹慎使用大觀霉素，能使淋球菌長期保持對大觀霉素敏感性，為新藥的研發或其他治療手段的發現提供更充足的時間。