?；撬釋π募〕衫w維細胞作用解析

王立英 卞良奇 蘇小偉 蘇海燕 劉絮 劉楠楠

摘?要?研究了?；撬幔═aurine， Tau）對新生大乳鼠心肌成纖維細胞（Myofibroblasts， myoFbs）增殖的抑制作用，并探討其作用機制。應用血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ， AngⅡ）誘導體外培養新生大乳鼠的myoFbs增殖，建立了心肌纖維化（Myofibrosis， MF）模型，基于甲基偶氮唑鹽法檢測myoFbs增殖。結果表明，不同濃度（0.03、0.06和0.12 mol/L）Tau均可顯著抑制myoFbs增殖，且呈現出劑量依賴性。進一步應用免疫細胞化學、激光共聚焦顯微鏡及 ELISA方法檢測了活性氧（Reactive oxygen species， ROS）、細胞周期蛋白E（Cell cycle protein E， CyclinE）、核轉錄因子κBp65（Nuclear factor-kappa Bp65， NF-κBp65）及轉化生長因子β1（Transforming growth factor-β1， TGF-β1）在myoFbs中的的表達及含量。研究結果表明，Tau是通過減少ROS的產生及TGF-β1的表達、抑制NF-κBp65的核轉位及CyclinE的表達，抑制myoFbs增殖，起到抗MF的作用。

關鍵詞??；撬? 心肌成纖維細胞; 甲基偶氮唑鹽法; 活性氧; 細胞周期蛋白E

1?引 言

?；撬幔═aurine， Tau）又稱β-氨基乙磺酸，是人體內含量極其豐富的自由氨基酸，在心肌組織中占總游離氨基酸含量的60% 以上。研究表明，Tau可通過調節細胞內外的滲透壓、調節Ca2+濃度的穩定及抗氧化等對心肌細胞起到保護性作用[1～3]。近年的研究還發現，Tau在體內及體外大鼠心肌纖維化（Myofibrosis， MF）模型中顯示出抗MF的作用[4～6]，但此作用與胞內何種信號分子有關及其作用機制目前尚不明確。本研究用AngⅡ誘導新生大乳鼠心肌成纖維細胞（Myofibroblasts， myoFbs）的增殖[1～3]，基于四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（Methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）、激光共聚焦、ELISA及熒光探針2，7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate（DCFH-DA）等定性和定量方法，獲得不同處理因素對對照組（Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM培養液）、模型組、Tau各劑量組對myoFbs增殖的影響，并進一步對檢測結果進行系統性對照和統計學分析，考察Tau抑制myoFbs的增殖是否與活性氧（Reactive oxygen species， ROS）、細胞周期蛋白E（CyclinE）、核轉錄因子κBp65（Nuclear factor-kappa Bp65， NF-κBp65）及轉化生長因子β1（Transforming growth factor-β1， TGF-β1） 等相關，探討Tau抑制myoFbs增殖的胞內信號轉導作用機制。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Olympus CK40倒置顯微鏡（日本Olympus公司）; HYBRID激光共聚焦顯微鏡（日本Lasertec公司）; Sunrise酶標儀（美國美谷分子儀器有限公司）; Sorvall低溫離心機（美國Thermo公司）。

?；撬幔兌?9%，國藥集團上?；瘜W試劑公司）; 血管緊張素Ⅱ、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT， 美國Sigma公司）; Iscove's Modified Dulbecco's Medium （IMDM）、胰蛋白酶（美國Bco公司）; 胎牛血清（杭州四季青生物公司）; 活性氧試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所）; TGF-β1檢測試劑盒（上海通蔚實業有限公司）; 羊抗大鼠CyclinE和NF-κBp65一抗（美國Santa Cruz公司）; S-P試劑盒（福州邁新生物技術開發公司）; 碘化丙啶（美國Biotium公司）; 二甲基亞砜（DMSO，蘇州聯雄精細化工科技有限公司）; DAB顯色液（北京博奧森生物技術有限公司）; FITC兔抗山羊二抗 （北京中杉金橋生物技術有限公司）。Wistar 大鼠的仔鼠（1～3日齡，雌雄兼用，清潔級），由吉林大學實驗動物中心提供。

2.2?MyoFbs分離及培養

取1～3日齡Wistar大鼠乳鼠，無菌開胸取其心臟，用預冷的D-Hank's沖洗心臟兩次后，將其剪成1 mm3的碎片，用胰蛋白酶（0.125%，w/V）多次消化（37℃， 5 min/次），收集上清液，1200 r/min離心10 min，棄去上清液，用含胎牛血清的IMDM培養基重懸沉淀細胞，將其接種于100 mL培養瓶中，于37℃、5% CO2培養箱內培養。實驗采用第2～3代細胞。

2.3?實驗分組及給藥

MyoFbs分為正常對照組、模型組、Tau各劑量組。各組細胞無血清培育12 h后，給予1%血清的IMDM培養基，除對照組外，均給予終濃度為1×107 mol/L的AngⅡ，Tau各劑量組的終濃度分別為0.03、0.06和0.12 mol/L。

2.4?細胞增殖檢測

將處于對數生長期的myoFbs制成細胞懸液，以1×105 cell/mL濃度接種于96孔板，每孔200 μL。分別給予不同的處理因素作用48 h。每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，37℃ 繼續培養4 h，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，于酶標儀上490 nm波長測吸光度（A）值，細胞增殖率（Cell proliferation rate， CPR）按下式計算：

式中， A1和A0分別為藥組和對照組的吸光度。

2.5?TGF-β1含量測定

取第3代myoFbs制成細胞懸液，以2.5×105 cell/mL濃度接種于24孔板，每孔1 mL。按2.3節的方法給予不同因素的處理，分別在培養48 h后吸取細胞上清液，用TGF-β1 ELISA試劑盒檢測TGF-β1的含量。

2.6?CyclinE和NF-κBp65蛋白表達的檢測

取第3代myoFbs放入預先放置了10 mm×10 mm蓋玻片的24孔板內，在37℃、5% CO2培養箱內培養48 h，再經無血清培育12 h，在不同條件下處理24 h后，將生長有myoFbs蓋玻片取出，用預熱PBS洗滌3次， 多聚甲醛（4%，w/V）固定30 min，晾干后用SP法進行細胞化學染色。陽性反應胞核呈棕黃色細密顆粒，陰性對照是用PBS代替一抗染色。應用Image-Pro Plus 5.0V （MediaCybernetics公司）圖像分析軟件分析各組CyclinE和NF-κBp65在myoFbs中表達的平均光密度值。

2.7?活性氧表達的檢測

24孔培養板培養myoFbs 48 h，無血清再培育12 h后，各處理因素再作用24 h后，用預熱的PBS洗滌3次，去除細胞培養液; 加入終濃度為10 mmol/L的DCFH-DA，于37℃、5% CO2培養箱內孵育20 min， 再用無血清培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，應用激光共聚焦顯微鏡觀察myoFbs內的ROS的水平。

2.8?統計學分析

用SPSS軟件進行實驗數據分析，通過方差分析及q檢驗進行組間比較，以p<0.05為有顯著差異且有意義; 實驗數據以±s表示。

3?結果與討論

3.1?Tau對myoFbs增殖的影響

體外實驗中，myoFbs的增殖程度用細胞增殖率表示，即各實驗組與對照組吸光度（A490為100%）的比值。模型組細胞增殖率值明顯高于對照組（p<0.01），Tau（0.03～0.12 mol/L）作用myoFbs 48 h后，與模型組相比，均可不同程度降低細胞增殖率值（p<0.01或p<0.05），且呈現量效關系。研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統（Renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的激活是誘發及引起 MF 的主要機制，AngⅡ不僅是常見的刺激信號，也是致器官纖維化的重要因子，尤其可引起MF [5～8]。AngⅡ與 AT1受體結合后激活蛋白激酶C，隨即啟動胞內信號途徑，促進 myoFbs增殖[6]。從實驗結果可知，Tau可抑制AngⅡ誘導的myoFbs增殖，具有抗MF及心肌保護性作用[12～14]。

3.2?Tau對TGF-β1含量的影響

AngⅡ作用于myoFbs 48 h后，細胞培養液中TGF-β1含量明顯升高，與對照組相比，差異顯著（p<0.01）; 經不同濃度Tau作用后，各組myoFbs細胞培養液中TGF-β1的蛋白含量均不同程度減少（p<0.05 或 p<0.01），結果見表1。在MF過程中，TGF-β1是一種促器官纖維化的因子。體內外實驗結果表明，MF與TGF-β1的異常表達密切[6，7]。TGF-β1不但能促進基質蛋白的合成，而且與AngⅡ密切相關。在MF過程中，TGF-β1與其受體結合，一方面AngⅡ能提高TGF-β1基因表達; 另一方面TGF-β1能促進myoFbs中I、III型膠原mRNA基因及細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）蛋白表達。TGF-β1對myoFbs的分化、增殖和胞外基質的沉積都具有極其重要的作用。離體實驗表明，AngⅡ可促進myoFbs分泌TGF-β1，而高表達的TGF-β1使胞外基質合成增加[8，9]。本研究結果表明，Tau可降低AngⅡ誘導myoFbs中的TGF-β1表達，抑制MF的發生。

3.3?Tau對CyclinE表達的影響

機體內的細胞周期蛋白包括Cyclin A、CyclinB、CyclinD、CyclinE、CyclinG及CyclinH，每種周期蛋白都與之關鍵的蛋白激酶相結合，并調節相應激酶活性，從而引起細胞周期的改變。Cyclin E是調節細胞周期的正向因子，可使細胞快速通過G0/S期。研究表明，過量表達的Cyclin E會使細胞G1期明顯縮短，提前進入S 期，干擾核酸的分裂和復制，干擾染色體的形成，促進中心體大量增殖以及干擾有絲分裂，促進細胞增殖，導致MF的發生?；罨蟮腃yclin E在胞核中表達為棕黃色或棕褐色顆粒，以胞核中出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。但對Cyclin E在細胞增殖中的作用，目前研究得較少[7～11]。本研究采用不同濃度Tau處理myoFbs 48 h后，從Cyclin E免疫細胞化學染色結果可見，對照組myoFbs核中Cyclin E的核表達量較少，AngⅡ組胞中Cyclin E的核表達較多，明顯高于對照組（p<0.01），不同劑量組的Tau均可抑制Cyclin E的核表達（p<0.01或p<0.05）。

3.4?Tau對myoFbs的NF-κBp65表達的影響

在正常情況下，P50/P65/IKB三聚體構成NF-κB，是重要的胞核轉錄因子，在胞漿中以無活性的形式存在。在氧自由基、細胞因子等外來刺激作用下，IkB迅速降解，隨即NF-κB被激活?；罨蟮腘F-κB轉移至核中，與相應的基因調節區域相結合，啟動基因轉錄。研究表明，NF-κBp65與細胞的增殖關系密切，通過增加NF-κBp65的核表達，可促進細胞的增殖。本研究應用免疫細胞化學染色技術觀察Tau對于NF-κBp65核表達的影響，不同濃度Tau與myoFbs孵育 48 h后，AngⅡ模型組細胞核黃褐色顆粒較多且核深染，與對照組相比，差異顯著（p<0.01）。不同濃度Tau可不同程度地減少myoFbs胞核黃褐色顆粒數量，即NF-κBp65的核表達減少（p<0.05）。上述結果說明，Tau可通過抑制NF-κBp65的核轉位，進而抑制myoFbs的增殖，達到抗MF的作用[7～11]。

3.5?Tau對ROS表達的影響

細胞在有氧代謝過程中產生的ROS，其主要功能是使細胞變性及壞死。此外，ROS可作為重要信號分子，參與到細胞信號轉導過程中，激活轉錄因子，影響基因的表達，從而促進細胞的增殖、分化。本研究利用活性氧檢測試劑盒測定ROS，探索ROS與myoFbs增殖之間的關系?；钚匝鯔z測試劑盒是利用熒光探針（DCFH-DA）進行 ROS檢測，DCFH-DA 本身無熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內，被胞內的酯酶水解，生成DCFH。而 DCFH 不能通透細胞膜，使探針很容易地被裝載到細胞內。細胞內的 ROS 可氧化無熒光的 DCFH，生成有熒光的DCF。檢測 DCF 的熒光即可知細胞內 ROS 的水平[6，8，11]。本研究中采用激光共聚焦顯微鏡觀察 myoFbs 胞漿內 ROS含量的變化，在 myoFbs 胞漿中可見綠色熒光顆粒，證明有ROS 產生，顆粒熒光越強，表明 ROS 量越高。實驗結果表明，過量的 AngⅡ可使 NADPH 氧化酶被大量激活，產生過量的ROS，參與了MF及心肌重塑的發生發展過程[6，8]。與對照組比較，AngⅡ模型組ROS產生量最多（p<0.01）; ?與模型組相比，Tau各組ROS產生量減少（p<0.01或p<0.05）。應用 Image-Pro Plus5.0V圖像分析軟件分析。

4?結 論

采用不同檢測技術，考察了Tau對新生大乳鼠心肌成纖維細胞增殖過程不同產物的影響，并進行系統性的數據解析，結果表明，Tau通過減少ROS和TGF-β1的生成、抑制CyclinE和NF-κBp65表達，抑制myoFbs增殖。本研究為臨床上抑制MF及心肌重塑提供了新思路，為相關生物學研究提供了有價值的基礎性參考數據。

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