骨關節炎氧化應激及干預的研究進展

周巧+劉健

【摘 要】 骨關節炎是一種常見的漸進性疾病，影響所有關節結構，包括軟骨、軟骨下骨、關節滑膜及其相鄰的支持結締組織，導致關節功能障礙。近年來越來越多的證據表明，氧化應激即自由基清除機制的失衡是骨關節炎發病的一個重要機制，氧化應激不僅導致軟骨破壞，同時參與炎癥介質的分泌和降解過程，促進從臨床無癥狀的軟骨破壞到明顯骨關節炎的過渡。中醫藥在抗氧化方面有顯著成效，故對氧化應激在骨關節炎中研究現狀及中藥干預進行綜述。

【關鍵詞】 骨關節炎；氧化應激；活性氧；活性氮；中藥干預；綜述

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的慢性疾病，導致關節功能受損，呈高齡化增長。氧化應激（OS）是指機體受各種有害刺激時產生過多的自由基、活性氧（ROS）或活性氮（RNS）和（或）機體抗氧化能力減弱，機體自身對ROS或RNS清除不足，導致體內ROS或RNS增多，破壞了機體原來的氧化/還原的平衡狀態，OA中OS則致局部關節內病變和滑膜炎癥，影響軟骨細胞的合成代謝過程，導致軟骨退化，是OA發病的重要機

制[1]。ROS或RNS直接或間接破壞軟骨細胞及軟骨細胞外基質（主要成分是膠原和蛋白聚糖），其中氨基酸的氧化修飾、亞硝基化、硝化和氯化都可改變蛋白質結構，從而損害其生物功能，以及線粒體DNA損害，影響軟骨細胞合成代謝，導致軟骨細胞衰老和凋亡[2]。Yudoh等[3]發現，在OA關節軟骨中，OS的存在導致端?；蚪M不穩定，致軟骨細胞衰老和調亡。中醫藥治療OA療效確切，通過清除自由基、抗氧化及抑制炎癥介質等保護軟骨細胞延緩病情發展。本文就近年來OS在OA中的發展及中藥干預方面進展做一綜述。

1 OS概述

1.1 定 義 ROS是體內一類氧的單電子還原產物，其產生主要是線粒體由狀態Ⅲ向狀態Ⅳ轉換中高氧的環境和高還原態的呼吸鏈使大量電子漏出并還原氧分子而形成。很多證據提示，在促凋亡信號作用下，ROS的升高可能作為第二信使上調促凋亡蛋白表達，促進線粒體通透性轉變孔的開放，激活天冬氨酸特異的半胱氨基酸酶，參與Ca2+途徑等，誘導細胞凋亡。在OA中，OS可以使細胞膜和核酸以及外成分包括蛋白多糖和膠原蛋白發生降解，還可致線粒體損傷包括線粒體DNA功能紊亂、抗氧化系統防御失調、鈣穩態失調、線粒體的細胞骨架破壞等，造成軟骨老化和退化[4-5]。

1.2 生物標志物 OS可影響OA進程，因此需要發現總結臨床相關的生物標記物，能夠判斷疾病發展進程及預后。OA患者中ROS相關標志物水平顯著升高已在既往文獻被觀察到[6]。自由基主要氧化損傷DNA、脂質以及蛋白質等大生物分子。DNA的測量值可以反映全身OS累積水平，主要的尿生物標記物有8-氧代-2'-脫氧鳥苷和8-氧鳥苷。對于脂質的氧化損傷主要有3個指標：血清中丙二醛（MDA），例如4-羥基-2-壬醇（4-HNE）可直接反映體內脂質過氧化的水平，硒谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），尿液或血漿中F2-異前列腺（F2-IsoPs）反映體內脂質氧化水平。蛋白質的氧化損傷主要有2個指標：蛋白羰基生成（羰基化）和二酪氨酸的生成（蛋白質中酪氨酸硝基化）。

1.3 抗氧化系統 機體內自身存在管理系統維持氧化還原平衡，它們能保持ROS生產和代謝之間的平衡，并保護細胞免受氧化損傷。消除ROS的抗氧化防御體系分為酶系和非酶系，前者有谷胱甘肽、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽S-轉移酶、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）、γ-L-谷氨?；?L-半胱氨酰（GSH）等；后者主要有還原性谷胱甘肽和一些小分子物質，例如維生素C、維生素E、維生素D3和煙酸或維生素B3的酰胺形式。此外，某些蛋白質（鐵蛋白、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、銅藍蛋白）作為抗氧化劑，可以結合和封存過渡金屬開始氧化反應。此外，血紅素加氧酶-1（HO-1）是血紅素代謝的限速酶，被認為能夠降低OS和抑制炎癥的抗氧化劑酶。

2 OS與OA的基礎研究

Suantawee等[7]將35例OA患者和35例健康對照者作為研究對象，通過測定血漿和滑液中亞硝酸鹽、MDA、維生素E的水平，以及鐵離子還原抗氧化能力（FRAP），比較2組的抗氧化能力（TEAC）。結果OA患者的滑液中維生素E水平明顯高于配對的血漿樣本，總抗氧化能力實驗組均較正常對照組顯著降低，表明OS可能是OA發病的主要機制。王桂珍等[8]對40例膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）患者血清SOD進行分析，結果血清SOD值低于正常參考值的例數及所占百分比為90%，表明SOD與KOA病情活動性密切相關。自由基對軟骨的損傷機制較為復雜，目前研究表明，OS可致關節軟骨基質、軟骨細胞和線粒體損傷，可能是OA的重要機制。Loeser等[9]

從正常人體關節軟骨分離出軟骨細胞在海藻酸珠中培養，OS由叔丁基過氧化氫（TBHP）誘導，免疫印跡分析細胞內信號，共焦顯微鏡用來測量核Smad4的易位。結果發現，OS通過抑制胰島素樣生長因子-1（IGF-1）刺激蛋白激酶磷酸化，減少成骨蛋白-1（OP-1）刺激Smad4的核易位，抑制IGF-1和OP-1刺激蛋白多糖合成。Yin等[10]也通過對正常和OA患者細胞中IGF-1信號通路進行比較，結果發現，OA軟骨細胞升高的ROS通過影響AKt與ERK通路的平衡而致軟骨細胞IGF-1抵抗，致軟骨細胞合成減少。Bhatti等[11]發現，抗氧化劑維生素E可以增加體外過氧化氫誘導的鼠軟骨細胞中蛋白多糖含量，降低亞硝酸鹽含量，同時提高軟骨細胞的存活率。Grishko等[4]發現，OA軟骨細胞中存在線粒體DNA的損傷，OS后線粒體DNA修復能力下降，細胞活力降低，軟骨細胞凋亡增加，證實了由OS引起的線粒體DNA損傷及修復能力下降可能導致OA的發展。近年的研究普遍認為，酶類和細胞因子在OA的發病中起著重要作用，酶類的降解失調、體內抗炎因子與促炎因子之間的平衡被打破，可致胞外基質的降解和軟骨的破壞。而高水平的氧自由基與免疫和炎癥密切相關，如關節滑液中性粒細胞、巨噬細胞、炎性滑膜等均可釋放過量氧自由基，從而加速OA的發生發展。Martin等[12]發現，促炎細胞因子白細胞介素（IL）-1β可以激活關節軟骨細胞ROS的產生，并通過活化激活蛋白-1（AP-1）和核轉錄因子-κB（NF-κB）的途徑誘導基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）

和MMP-13的合成和分泌，導致基質降解損傷軟骨細胞。NADPH氧化酶（NOX）是ROS的主要酶體。Rousset等[13]發現，HO-1表達能抑制NADPH氧化酶4的活性，從而減少MMP-1的分泌，減少軟骨細胞死亡。

自噬是在OS條件下控制細胞穩態的關鍵機制。既往研究發現，自噬可能通過降低細胞內ROS水平間接減少細胞器的損傷進而起到削弱凋亡的作用[14]。據報道，FOXO蛋白作為轉錄因子激活自噬蛋白質如LC3和Beclin1基因以調節自

噬[15]。Akasak等[16]研究發現，下調FOXO轉錄因子的表達將會增加OS，誘導軟骨細胞調亡，可能與抗氧化劑和自噬相關蛋白（LC3和Beclin1基因水平）減少有關?？筄S細胞保護機制包括通過轉錄因子如核因子E2相關因子2（Nrf2）的轉錄控制細胞保護酶。

3 中藥干預OS

程園園等[17]觀察新風膠囊（主要成分為黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等）對KOA患者B、T淋巴細胞衰減因子（BTLA）及SOD變化的影響，通過流式細胞術檢測BTLA表達頻率及活化水平，比色法測定血清SOD，酶聯免疫吸附法檢測2組血清中IL-10、IL-1β、MDA，結果新風膠囊能提高KOA患者外周血BTLA表達，抑制T細胞活化，降低異常免疫反應和OS損傷。賴震等[18]

觀察海桐皮湯熏蒸對兔KOA氧自由基代謝的影響，分組造模后4周檢測實驗前后兔血清SOD活性和MDA含量，結果2組比較，模型組治療后SOD活性降低，MDA含量升高，實驗組SOD活性升高，MDA含量降低，表明海桐皮湯熏蒸可在一定程度上降低OA氧自由基含量，延緩關節軟骨的退變，促進軟骨修復。李振華等[19]研究鹿茸多肽對OA軟骨細胞的氧化損傷的逆轉作用，對15只日本兔造模后體外分離培養軟骨細胞，

8周后用DCFH-DA法檢測細胞內ROS水平，Griess法測定細胞培養上清中NO、SOD和GSH-Px含量，結果發現，一定濃度的鹿茸多肽顯著提高兔軟骨細胞培養上清中SOD和GSH-Px水平。傅強等[20]運用骨刺消合劑（熟地黃、黃芪、補骨脂、威靈仙等）治療KOA患者60例，結果骨刺消合劑組患者血清中SOD含量上升，NO和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量下降。李建斌等[21]將76例KOA患者隨機分組，治療組口服仙靈骨葆膠囊（主要成分為淫羊藿、續斷、補骨脂、地黃、丹參、知母等），對照組口服雙氯芬酸鈉，觀察治療前后膝關節液中NO、SOD和MDA的含量，結果治療組用藥8周后血漿中SOD活性明顯提高，MDA含量和NO活性比治療前顯著下降。Kim等[22]研究人參皂苷Rb如何調節軟骨基因及促炎因子達到軟骨保護作用，培養的大鼠關節軟骨細胞分別用

100 μM的人參皂苷Rb1和（或）500 μM的過氧化氫（H2O2），并評估存活率，ROS、NO水平和軟骨基因表達，結果發現，人參皂苷Rb1減少IL-1β和TNF-α的釋放，促進軟骨基因如Ⅱ型膠原和SOX9的表達，抑制MMP-1、MMP-13，以及NO和細胞內ROS的產生。張沖等[23]觀察補腎固筋方對KOA患者IL-1、iNOS水平的影響，采用酶聯免疫吸附法檢測IL-1、iNOS的含量，結果治療后中藥組（口服補腎固筋方）和對照組（口服美洛昔康膠囊）IL-1、iNOS水平較治療前均增高；中藥組關節液和血清IL-1、iNOS相比，對照組顯著降低。提示中藥補腎固筋方通過調節細胞因子的表達水平來調控細胞凋亡和減輕軟骨破壞，改善KOA發生及發展。

4 小 結

綜上所述，OS在OA中發揮重要作用，ROS的產生和清除平衡失調、氧化和抗氧化的失衡均可導致相關的生物大分子及軟骨損傷，繼而導致疾病的發生和進展。積聚的ROS或RNS誘導軟骨細胞衰老和凋亡，并損害其功能，破壞軟骨的結構完整性，導致關節軟骨的功能障礙。對OS與OA關系的研究可加深對OA發病機制的認識，為臨床正確使用藥物及研究新藥提供指導及思路。同時中藥及其有效活性成分在清除自由基方面具有較大的優勢和潛力，許多化學成分如黃酮類、三萜類等都已經在清除自由基方面顯示出較好的活性[24]。

OS影響軟骨和軟骨下骨代謝是非常復雜的；但目前對如何維持軟骨細胞氧化還原穩態及其相關機制和通路卻知之甚少，需要更多的研究闡明OS、軟骨和OA之間的復雜關系。研究發現，調節氧化和抗氧化平衡的方法及途徑，從而減少自由基所致的OA軟骨組織的損傷。同時應加強中藥調控OA軟骨細胞凋亡的理論和臨床研究，從多角度、多層次深入揭示中醫藥發揮藥效作用靶點及調控機制，為臨床上OA治療提供新方法和思路。

5 參考文獻

[1] Alcaraz MJ，Megías J，García-Arnandis I，et al.New molecular targets for the treatment of osteoarthritis[J].Biochem Pharmacol，2010，80（1）：13-21.

[2] Facchini A，Stanic I，Cetrullo S，et al.Sulforaphane protects human chondrocytes against cell death induced by various stimuli[J].J Cell Physiol，2011，226（7）：1771-1779.

[3] Yudoh K，Nguyen vT，Nakamura H，et al.Potential involvement of oxidative stress in cartilage senescence and development of osteoarthritis：oxidative stress induces chondrocyte telomere instability and downregulation of chondrocyte function[J].Arthritis Res Ther，2005，7（2）：380-391.

[4] Grishko VI，Ho R，Wilson GL，et al.Diminished mitochondrial DNA integrity and repair capacity in OA chondrocytes[J].Osteoarthritis Cartilage，2009，17（1）：107-113.

[5] Sauter E，Buckwalter JA，McKinley TO，et al.Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage[J].J Orthop Res，2012，30（4）：593-598.

[6] Kotani K，Sakane N，Kamimoto M，et al.Levels of reactive oxygen metabolites in patients with knee osteoarthritis[J].Australa J Ageing，2011，30（4）：231-233.

[7] Suantawee T，Tantavisut S，Adisakwattana S，et al.Oxidative Stress，Vitamine，and antioxidant capacity in knee osteoarthritis[J].J Clin Diagn Res，2013，7（9）：1855-1859.

[8] 王桂珍，張金山.膝骨關節炎患者超氧化物歧化酶變化及相關性分析[J].中醫藥臨床雜志，2011，23（6）：530-531.

[9] Loeser RF，Gandhi U，Long DL，et al.Aging and oxidative stress reduce the response of human articular chondrocytes to insulin-like growth factor-1 and osteogenic protein 1[J].Arthritis Rheumatol，2014，66（8）：2201-2209.

[10] Yin W，Park JI，Loeser RF.Oxidative stress inhibits insulin-like growth factor-1 induction of chondrocyte proteoglycan synthesis through differential regulation of phosphatidylinositol 3-Kinase-AKt and MEK-ERK MAPK signaling pathways[J].J Bio Chem，2009，284（46）：31972-31981.

[11] Bhatti FU，Mehmood A，Wajid N，et al.Vitamin E protects chondrocytes against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in vitro[J].Inflamm Res，2013，62（8）：781-789.

[12] Martin G，Bogdanowicz P，Domagala F，et al.Rhein inhibits interleukin-1 beta-induced activation of MEK/ERK pathway and DNA binding of NF-kappa B and AP-1 in chondrocytes cultured in hypoxia：a potential mechanism for its disease-modifying effect in osteoarthritis[J].Inflammation，2003，27（4）：233-246.

[13] Rousset F，Nguyen MV，Grange L，et al.Heme oxygenase-1 regulates matrix metalloproteinase MMP-1 secretion and chondrocyte cell death via Nox4 NADPH oxidase activity in chondrocytes[J].PLoS One，2013，8（6）：e66478.

[14] Kroemer G，Mari?o G，Levine B.Autophagy and the integrated stress response[J].Molecular Cell，2010，40（2）：280-293.

[15] Ferdous A，Battiprolu PK，Ni YG，et al.FoxO，autophagy，and cardiac remodeling[J].J Cardiovasc Transl Res，2010，3（4）：355-364.

[16] Akasaki Y，Alvarez-Garcia O，Saito M，et al.FoXO transcription factors support oxidative stress resistance in human chondrocytes[J].Arthritis Rheumatol，2014，66（12）：3349-3358.

[17] 程園園，劉健，萬磊，等.新風膠囊對膝骨關節炎患者B、T淋巴細胞衰減因子及氧化應激的影響[J].免疫學雜志，2013，29（5）：416-421.

[18] 賴震，石仕元，費駿，等.海桐皮湯熏蒸對兔實驗性膝骨關節炎氧自由基代謝的影響[J].浙江中西醫結合雜志，2012，22（12）：938-940.

[19] 李振華，趙文海，周秋麗.鹿茸多肽對抗骨關節炎軟骨細胞氧化損傷作用的實驗研究[J].中國骨傷，2011，24（3）：245-248.

[20] 傅強，牛鋒，張利勇，等.骨刺消合劑對膝骨關節炎患者血清中超氧化物歧化酶、一氧化氮及腫瘤壞死因子α的影響[J].長春中醫藥大學學報，2015，31（6）：1230-1232.

[21] 李建斌，劉聯華，吳琦明.仙靈骨葆膠囊對膝骨關節炎患者關節液自由基水平的影響[J].內蒙古中醫藥，2010，29（10）：3-4.

[22] Kim S，Na JY，Song KB，et al.Protective Effect of Ginsenoside Rb1 on Hydrogen Peroxide-induced Oxidative Stress in Rat Articular Chondrocytes[J].J Ginseng Res，2012，36（2）：161-168.

[23] 張沖，高海燕，黃蕓，等.傳統中醫藥補腎固筋方對中老年膝骨關節炎患者IL-1、iNOS水平的影響和臨床意義[J].中國骨質疏松雜志，2015，21（7）：780-783.

[24] 齊亞軍，劉健，曹云祥，等.風濕病的氧化應激及干預研究進展[J].中華中醫藥學刊，2013，31（12）：2606-2609.

收稿日期：2016-07-15；修回日期：2016-08-29