貯存溫度及形態對甜櫻桃花粉耐貯性的影響研究

張 琦,劉 濤,王雅楠,支玉璽,高慶，蔡宇良*

( 1.西北農林科技大學園藝學院；2.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；3.武功縣園林工作站，陜西武功 712200)

歐洲甜櫻桃(Cerasusavium)為薔薇科(Rosaceae)櫻屬(Cerasus)植物[1]，又稱甜櫻桃、西洋櫻桃、大櫻桃，歐洲甜櫻桃較中國櫻桃、毛櫻桃、酸櫻桃有著外形美觀、鮮艷亮澤、果實大、果肉多厚且柔軟多汁、味道甜美、口感好、耐儲運等明顯優點。櫻桃素有“百果第一枝”、“水果中的鉆石”等美譽，春末夏初(4月下旬至6月下旬)成熟，櫻桃的上市填補了新鮮水果的市場空白，對調節鮮果供應、平衡市場供需與滿足人民對美好生活的需要有很大的意義和作用[2]。此外櫻桃加工產品以其營養健康、種類豐富和較高品質廣泛受到市場和消費者追捧。甜櫻桃以其優良的果品特性、較高的商品價值、較早的上市時間近年來一直將我國櫻桃產業的主導地位牢牢占據[3]。

櫻桃為雌雄同花，中國櫻桃與酸櫻桃花粉多、自花結實能力強，除艷陽、拉賓斯、斯坦勒、斯塔克、艷紅等少數品種有較高的自花結實能力外大部分甜櫻桃品種都明顯的自花不實，而且品種之間的親和性也存在很大不同。在果樹生產中，往往因為果園中搭配的授粉樹少、品種不合理，加之受到天氣影響，例如果樹在花期遭遇大風、低溫而造成蜜蜂不能進行正常的自然授粉而造成產量、品質下降，同時隨著設施農業的發展，甜櫻桃設施保護地栽培的大力推廣，由于其栽培環境與生長習性的改變，出現了花粉生活力普遍較低的現象，其中有的甚至不足10%，較低的花粉生活力是設施櫻桃開花卻不坐果的主要原因之一[4]。對于自花不實的果樹提高結實率的最關鍵、最有效途徑就是進行品種間的異花授粉，同時人工授粉也是雜交選育櫻桃新品種、提高櫻桃品質、抵抗花期惡略自然環境的重要途徑，而通過授粉受精獲得優質、豐產，培育出新品種的基礎就是花粉生活力，果園的產量和雜交試驗的成敗直接受到花粉數量多少和生活力高低的影響[5]。因此，通過建立花粉預備制度，提前采集自然條件下的高生活力花粉進行貯存保鮮，待大田甜櫻桃花期遇到不良天氣、大棚甜櫻桃花期、開展雜交育種工作時進行人工授粉可以促進甜櫻桃生產、科研的優質、高效[6]。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地點

1.1.1 試驗材料

供試材料有：先鋒、艷陽、吉美、雷尼、斯坦拉共5個甜櫻桃品種花粉，2017年4 月初、2018年3月中下旬于陜西省西安市周至縣二曲鎮渭中村西北農林科技大學渭河櫻桃試驗示范站和陜西省寶雞市眉縣試驗站采集，分別用于花粉生活力測定、貯存試驗和花粉數量、含水量的測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉的采集、制作、保存

(1)花粉的采集制作

根據花的開放程度分時對先鋒、艷陽、吉美等5個不同甜櫻桃品種分別采集花朵以收集花粉。在各品種花蕾期采集雄蕊松散、花藥變黃但尚未開放的“鈴鐺花”，每個品種采集至少500朵花，采下后立即放入4 ℃恒溫冰箱內。在避風條件下迅速用鑷子將花藥從雄蕊上剝離，將各個品種花藥分品種標記后，分別置于25 ℃條件下烘干24 h。

(2)研磨前處理

花粉保存形態設置花藥和花粉兩個水平，待花藥干燥后，將一部分干燥好的花藥進行研磨處理，研磨時將花藥放在硫酸紙紙夾層中，使用光滑的器具輕輕反復研磨，將未散粉的花藥壁擠破，使其中的花粉充分釋放出來，研磨時要注意研磨力度，謹防機械損傷導致花粉破裂而失活，將釋放出來的花粉過60目篩后收集至離心管中；另一部分直接收集在離心管中，用密封紙、錫箔包裹兩層后做好標記裝入自封袋中。

(3)貯存溫度試驗處理

花粉貯存溫度分為4個水平，將花藥、花粉分別置于室溫(14～19 ℃)和4、-20、-80 ℃恒溫條件下。各處理重復3次。

1.2.2 花粉數量測定 采用蔗糖懸浮液法和果膠酶酶解法對吉美、艷陽、先鋒三個甜櫻桃品種花粉數量進行測定，將兩種懸浮液的測定效果進行對比，分別選用載玻片直接計數法和血球計數板法測定單克花粉量和單藥出粉量，重復6次[7-8]。單藥花粉量和單克花粉量計算公式如下：

單藥花粉量(粒)=(每個載玻片上總花粉粒數×200)/12

單克花粉量(粒)=5個中方格的花粉粒數/5×10×103×100

1.2.3 花粉含水量測定 采用王小敏等[9]的烘干法測定花粉含水量，將新鮮花粉置于干燥的稱量盒中，烘箱設定溫度25 ℃，待24，48，72 h直至恒重取出測定重量，通過計算得出各品種花粉含水量值。

花粉含水量=(W2-W3)/(W2-W1)×100%(W1為干燥的稱量盒重，W2為稱量盒內放入花粉后重，W3為干燥后恒重)。

1.2.4 花粉生活力測定 取已滅菌的潔凈雙凹載玻片，在載玻片凹處滴加經滅菌后的15%蔗糖、15 mg·L-1硼酸、0.5%瓊脂的培養基溶液[10]2～3滴，確保蓋玻片蓋上后不溢出，待培養基溶液凝固后，將少許花粉粒播于培養基中，蓋上蓋玻片。于23～25 ℃組織培養室內培養48 h[11]后在顯微鏡下觀察花粉萌發和花粉管生長的情況，以花粉管伸長超過花粉直徑為標準[12]。每品種重復3次，各重復按梅花法隨機選取5個視野進行觀察，每個重復中觀察不少于100?；ǚ?，進行統計計算。

花粉生活力=(花粉管長度大于花粉粒直徑的花粉數量/觀察花粉數量)×100%

1.3 數據處理

用Microsoft Office Excel 2016軟件作圖并進行差異顯著性檢驗。

2 結果和分析

2.1 花粉含水量

對斯坦拉、艷陽、先鋒、雷尼、吉美5個甜櫻桃品種進行花粉含水量測定，各品種花粉分別在稱量瓶內烘干24，48，72，72，96 h達到恒重，花粉含水量測定結果見表1，晚熟品種吉美花粉含水量最高為68.62%，分別高出中熟品種艷陽、先鋒、雷尼花粉10.34%，19.99%，24.5%，高出早熟品種斯坦拉28.97%，。此外，不同品種花粉在25 ℃條件下烘干24 h后平均含水量不同，為4.98%～6.10%，從高到低依次為吉美、艷陽、先鋒、雷尼、斯坦拉。

表1 不同甜櫻桃品種花粉含水量 單位：%

注：表中“±” 后數字表示標準偏差，下同。

2.2 花粉數量

采用果膠酶酶解法所測得的單藥出粉量、單克花粉量如表2所示。先鋒、吉美、艷陽的單藥平均出粉量分別為2 711粒、2 120粒、1 952粒。其中，先鋒的單藥出粉量分別較吉美和艷陽高27.88%和38.88%，而吉美和艷陽的單藥出粉量無顯著差異。吉美、艷陽、先鋒的單克花粉量分別為51.3×106，20.0×106，50.4×106。其中，先鋒和吉美的單克花粉量顯著高于艷陽，而前兩者間無統計學差異。

表2 不同品種甜櫻桃花粉數量 單位：粒

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

據采集時統計，吉美、艷陽、先鋒的單花出藥量分別為30粒、32粒、38粒，由表2可計算出吉美、艷陽、先鋒三種甜櫻桃的單花出粉量，計算結果表明，在三種供試甜櫻桃中，單花出粉量最多的先鋒為103 000粒，其次為吉美64 000粒，艷陽最少為62 000粒。

2.3 花粉生活力

25 ℃烘干24 h后采用花粉離體培養法測定的吉美、艷陽、先鋒、雷尼、斯坦拉等5個甜櫻桃品種花粉生活力如圖1所示，可看出5個品種中先鋒花粉生活率最高，為66.74%，艷陽次之，為49.29%，雷尼花粉生活力最低為43.44%?？梢娫?5 ℃烘箱內烘干24 h后花粉生活力仍保持較高的水平。

圖1 不同品種甜櫻桃25 ℃條件下烘干24 h的花粉生活力)

2.4 貯存形態對花粉生活力的影響

由圖2可知，在室溫和4 ℃條件下吉美、先鋒以花粉形態貯存與以花藥形態貯存的效果大致相同，艷陽以花藥形態貯存的花粉生活力高于以花粉形態貯存的花粉，其差值最高可達27.24%，其中4 ℃條件下以花粉形態貯存的艷陽花粉完全失活時間早于以花藥形態貯存的花粉最長，可達90 d。在-20 ℃和-80 ℃下保存，吉美前7 d中以花粉形態貯存的花粉生活力高于以花藥形態貯存的花粉，隨后低于以花藥形態貯存的花粉，在-20 ℃第225 d時，其差值達到最大值，為28.77%；艷陽以花藥形態貯存的花粉生活力在貯存過程中均高于以花粉形態貯存的花粉生活力，在第255 d時差值最大為32.98%；先鋒在長期貯存過程中，除-80 ℃溫度下第285 d外，以花藥形態貯存的花粉生活力僅略高于以花粉形態貯存的花粉生活力?？傮w上看，長期貯存過程中以花藥形態貯存的花粉生活力高于花粉形態貯存的花粉。

2.5 貯存溫度對花粉生活力的影響

室溫下吉美、艷陽、先鋒三種甜櫻桃花粉生活力均在貯存前5 d內明顯下降，15 d時花粉生活力均降低至10%以下，45 d時完全失去生活力?？梢?，室溫不適用于花粉的貯存。在貯存的第45 d后，在4、-20、-80 ℃溫度條件下貯存的花粉生活力下降速度較之前逐漸放緩。貯存時間達120 d后花粉生活力呈現明顯降低趨勢，4 ℃降低最快，-20、-80 ℃貯存的花粉生活力損失較小。在4 ℃中貯存的花粉在第165 d時出現多數萌發率、染色率為零的視野，萌發率降低至10%左右，此時貯存價值較低，吉美、艷陽在第195 d即完全失活，先鋒在貯存第315 d完全失活，已失去貯存價值。貯存第225 d時，在-20 ℃下貯存的艷陽花粉生活力降低至37.92%，與貯存前相差近11個百分點。各品種-80 ℃下貯存的花粉生活力與-20 ℃溫度下貯存的花粉基本相當，隨著貯存時間的延長，觀察到的花粉管長度呈漸短趨勢，花粉萌發的一致性較未貯存之前差。當花粉在-20、-80 ℃繼續貯存至365 d時，各品種花粉生活力均有較為明顯的下降，各品種花粉生活力為23.32%～36.22%?？梢?，甜櫻桃花粉在-20 ℃和-80 ℃溫度條件下進行周年貯存可滿足科研和生產中人工授粉對花粉生活力的需求。

3 討論與結論

甜櫻桃單藥花粉量分為5類，粒數小于700粒為極少量，201～1 400粒的為少量，1 401～2 100粒為中等，2 101～2 800粒為多，2 800粒以上為極多[13]，吉美、先鋒單藥出粉量多，而艷陽出粉量中等。度的干燥有利于花粉的保存，20%以下的花粉含水量有利于桃花粉超低溫保存其中以13%～21%最佳[14]，蔗茅花粉含水量在10%以下、垂絲海棠花粉含水量為10%時置于低溫條件下可延長其貯存時間[15-16]。本試驗中吉美、艷陽、先鋒、斯坦拉、雷尼五個甜櫻桃花粉總含水量在介于39.65%～68.62%間，且含水量越高的花粉表現出的花粉生活力越低。在25 ℃溫度條件下烘干24 h后含水率降至4.98%～6.1%，此時花粉生活力為43.44%～66.74%，可見在25 ℃烘箱內烘干24 h可作為花粉貯存前的干燥處理方法，但25 ℃烘干24 h是否是甜櫻桃貯存前最適宜的干燥處理組合，甜櫻桃花粉含水量與花粉生活力、花粉耐貯存性之間的關系有待進一步設計試驗探究。

雖然花蕾期花粉生活力顯著低于盛花期[5]，但考慮到花粉純度等方面因素，本試驗采集鈴鐺花進行花粉樣本收集。本試驗在前人研究[11,13,17-18]的基礎上，對陜西省主栽和示范推廣的5個品種花粉生活力進行了測定，其結果與前人研究結論較為一致。本試驗表明以花藥形態貯存的花粉較以花粉形態貯存的花粉有更好的耐貯存性，原因可能是花藥的含水量較高的花藥壁具有保護作用；為提高花粉保存后的生活力，生產中花粉研磨操作規程有待進一步試驗研究。

果樹花粉冷凍保存被認為是所有研究貯存模式中最有利的一種，前人的研究品種多局限在當地主栽品種，本試驗探索了陜西省優質品種花粉的長期保存，為跨時間、跨地域的科學研究和生產實踐提供了參考。甜櫻桃花粉對貯藏條件敏感，室溫不適于甜櫻桃花粉貯存，其貯存時間不應超過11～13 d。低溫可影響花粉貯存中的活力保持，吉美、艷陽、先鋒三種甜櫻桃花粉可在4 ℃條件下進行2.5個月以內的短期貯存，但在-20 ℃低溫和-80 ℃超低溫條件下可以實現周年貯存，且均能保持貯存前40%以上的花粉生活力，可滿足授粉需要，花粉在兩溫度下貯存效果相差不大，考慮到實際生產條件和成本，建議選擇在-20 ℃低溫條件下對甜櫻桃花粉進行貯存。低溫保存花粉會出現“冷刺激”效應，生活力呈增加趨勢[19]，本試驗低溫貯存中花粉生活力降低可能是在取樣過程中由于冰箱與室外溫度差導致花粉吸水造成花粉含水量升高，且過程中未及時做干燥處理造成的。在生產中應選擇可與主栽品種授粉、花粉數量多、花粉生活力強的品種生產花粉，吉美、艷陽、先鋒三個品種甜櫻桃花粉均適宜作為花粉生產品種，其中以先鋒最為適宜。