Notch信號通路促進滑膜肉瘤細胞SW982增殖和侵襲的研究

高天，余鈴，李舒，劉佳勇，白楚杰，薛瑞峰，張路，方志偉，樊征夫

（1. 北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所骨與軟組織腫瘤科，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142； 2. 武漢大學人民醫院骨1科，武漢 430060）

滑膜肉瘤是一種臨床上常見的高度惡性軟組織肉瘤，好發于青壯年且多在關節周圍［1-2］。盡管手術聯合放化療的治療手段使患者5年生存率達到60%，10年生存率仍然極低［3］。Notch信號通路是一種進化中高度保守的跨膜受體信號通路家族，其所編碼的單鏈跨膜受體蛋白在細胞的分化、個體發育的中起關鍵作用［4］。Notch信號通路包括Notch受體、配體、修飾蛋白及靶點轉錄因子。配體與受體結合后，Notch受體發生裂解并釋放Notch受體胞內段（Notch intracellular domain，NICD），隨后NICD進入細胞核調控靶基因轉錄［5］。研究［6-8］發現Notch信號通路的失調控參與多種腫瘤的發生發展，如血液系統腫瘤、乳腺癌、胰腺癌等。Notch信號通路對滑膜肉瘤的影響尚未見報道，本研究擬探討Notch通路相關蛋白在滑膜肉瘤細胞SW982中的表達狀態及Notch通路對SW982細胞增殖及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人滑膜肉瘤細胞株SW982購自美國菌種保藏中心 （American Type Culture Collection，ATCC）。SW982細胞常規培養于含10%胎牛血清、1% 100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的L-15專用培養基中，置于37℃、5% CO2的培養箱中進行常規培養。

1.2 細胞轉染

NICD1過表達、CBF1-shRNA慢病毒和陰性對照病毒均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。根據慢病毒轉染手冊對滑膜肉瘤細胞進行轉染，從而得到SW982-Notch上調、W982-Notch下調細胞株。轉染的細胞培養72 h后，用嘌呤霉素 （3 μ g/mL） 孵育48 h。篩選后的滑膜肉瘤細胞株即為穩定轉染細胞株。

1.3 CCK-8實驗

細胞分為SW982正常對照組、SW982-Notch上調組、W982-Notch下調組和DAPT處理組。收集各組細胞制成細胞懸液，用PBS調整細胞密度至1×105/mL。接種于96孔板中，每孔200 μ L，培養24 h，細胞貼壁后分別加入終濃度1、2、4、8 μ mol/L的DAPT，轉染組細胞直接培養。培養24 h后，每孔加入10 μ L CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。采用酶標儀檢測450 nm處的光密度值 （optical density，OD），計算細胞增殖率，每組實驗均重復3次。

1.4 劃痕實驗

將各組細胞用L-15專用培養基 （含10%胎牛血清） 培養于6孔板上，待融合后，用滅菌槍頭劃直線，劃痕后 0～24 h，用反轉的 Olympus IX50 顯微鏡通過10 倍物鏡和Image-ProPlus軟件捕獲測量劃痕面積。所有實驗重復 3 次，劃痕面積越大，表示遷移能力越弱。

1.5 qPCR檢測NOTCH-1、 HES-1、 HES-5、 HEY-1基因mRNA表達水平

按照Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行操作，抽提完成后，加入20 μ L無RNA酶水，至完全溶解，紫外分析測定所抽提RNA的濃度。取5 μ g按逆轉錄試劑盒說明逆轉錄cDNA。以cDNA為模板PCR擴增NOTCH-1、HES-1、HES-5和HEY-1，以GAPDH為內參照。各基因引物序列如下：NOTCH-1：5’-GGCACT TTCTGTGAGGAGGAC-3’，5’-GCAGTCAGGCGTGTT GTTCT-3’。HES-1：5’-ATTCTGGAAATGACAGTGA AGCAC-3’，5’-CACCTCGGTATTAACGCCCTC-3’。HES-5：5’-GAAGCCGGTGGTGGAGAA-3’，5’-GCTTG GAGTTGGGCTGGTG-3’。 HEY-1：5’-GAAGCAGG TAATGGAGCAAGGA-3’，5’-GAAGCGTAGTTGTTGA GATGCG-3’。GAPDH：5’-ACTTTGGTATCGTGGAA GGACTCAT-3’，5’-GTTTTTCTAGACGGCAGGTCAG G -3’。PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 s，94 ℃ 30 s，-60 ℃ 30 s，-72 ℃ 30 s，共40個循環； 溶解曲線條件：95 ℃ 15 s，-60 ℃ 30 s，-95 ℃ 15 s。 基因相對表達水平通過2-△△Ct法計算。

1.6 Western blotting法檢測NOTCH-1及HES-1蛋白表達水平

取各組細胞棄去培養液，PBS洗滌3 次，提取細胞蛋白并定量。取適量裂解產物，以1∶4比例加入樣品與緩沖液，進行SDS-PAGE，電泳完成后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應一抗于4 ℃孵育4 h，TBST 洗滌20 min；加入相應二抗于室溫孵育1 h，TBST 洗滌20 min；顯色，成像掃描分析系統保存圖像。

1.7 統計學分析

數據采用SPSS 15.0 統計軟件進行分析，實驗結果采用±s表示，組間差異采用單因素方差分析，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Notch信號通路相關蛋白在滑膜肉瘤細胞SW982中表達增高

NOTCH-1受體和目的基因 HES-1、 HES-5及HEY-1 在人滑膜肉瘤細胞SW982中mRNA表達水平明顯高于正?；ぜ毎?，分別較對照組提高1.67±0.36、1.75±0.48、1.56±0.21和1.62±0.25倍，差異有統計學意義 （P < 0.05，圖1A）。Western blotting結果同樣顯示，NOTCH-1蛋白和其目的基因HES-1在人滑膜肉瘤細胞SW982中表達水平顯著高于正?；ぜ毎?（圖1B）。

2.2 上調Notch信號通路對滑膜肉瘤細胞SW982增殖及侵襲的影響

圖1 正?；ず蚐W982細胞中Notch通路相關基因表達Fig.1 Expression of Notch signaling pathway related genes in normal synovial cells and SW982 cells

利用慢病毒轉染技術構建NICD1持續表達的細胞SW982株。通過qPCR和 Western blotting 技術對NICD1表達發揮的Notch信號通路激活作用進行驗證。qPCR結果顯示，NOTCH-1及其靶基因HES-1，HES-5，HEY-1的mRNA表達量明顯增高，平均較對照組提高1.58±0.27倍，差異有統計學意義 （P <0.05，圖2A）。Western blotting驗證也發現蛋白表達水平與mRNA表達相符 （圖2B）。對Notch上調細胞SW982及對照細胞SW982進行增殖能力測定，CCK8結果顯示，24～72 h時間范圍內Notch上調的細胞SW982增殖能力明顯強于對照細胞SW982，24 h、48 h及72 h較對照組分別提高1.24±0.08、1.48±0.18和1.72±0.47倍，差異有統計學意義 （P < 0.05，圖2C）。劃痕實驗發現，Notch上調的細胞SW982侵襲能力與對照細胞SW982在24h無明顯差別。但在48 h時，Notch上調的細胞SW982遷移距離明顯長于對照細胞SW982 （圖2D）。

圖2 過表達NICD1上調Notch通路活性，增加SW982的增殖和侵襲能力Fig.2 The proliferation and invasion of SW982 cells were upregulated following NICD1 overexpression

2.3 下調Notch信號通路對滑膜肉瘤細胞SW982增殖及遷移的影響

利用qPCR技術進行驗證，下調組靶基因mRNA水平僅為對照組的46.3%±10.0%，差異有統計學意義 （P < 0.05，圖3A），Western blotting實驗也驗證了上述結果 （圖3B）。對Notch下調的細胞SW982及對照細胞SW982進行增殖能力測定，CCK8結果顯示，24～72 h時間范圍內Notch下調的細胞SW982增殖能力明顯低于對照細胞SW982，24 h、48 h及72 h分別為對照組的72.3%±13.2%、57.6%±11.0%和34.6%±7.5%，差異有統計學意義 （P < 0.05，圖3C）。劃痕實驗發現，Notch下調的細胞SW982遷移能力與對照細胞SW982在24 h無明顯差別，48 h時Notch下調的細胞SW982遷移距離明顯短于對照細胞SW982（圖3D）。

2.4 DAPT對滑膜肉瘤細胞SW982增殖和侵襲的影響

圖3 干擾CBF1表達下調Notch通路活性，抑制SW982的增殖和侵襲能力Fig.3 The proliferation and invasion of SW982 cells were downregulated following CBF1 knockdown

CCK8檢測發現，用不同濃度DAPT處理后，細胞SW982在24～72 h時間范圍內增殖受到明顯抑制，且抑制作用有明顯劑量依耐性和時間依耐性。在一定范圍內，隨著DAPT劑量的增加 （1，2，4，8 μ mol/L） 和作用時間的延長，細胞SW982增殖抑制效果明顯增加，DAPT 8 μ mol/L處理72 h的抑制率可達到87.3%±7.0%，差異有統計學意義 （P < 0.05，圖4A）。

劃痕實驗結果顯示，4 μ mol/L的DAPT孵育細胞SW982 48 h后，細胞遷移的數量明顯減少。與對照組相比，有統計學差異 （圖4B）。

3 討論

在大多數滑膜肉瘤中存在特異性的染色體 t（X；18） （p11. 2；q11. 2） 易位，并在斷裂處形成融合基因SYT-SSX［9］，而這種融合基因帶來的下游改變尚不清楚。在FRANCIS等［10］的研究中，對大量的軟組織肉瘤樣本行基因表達譜分析，其中包括31 例滑膜肉瘤的樣本，結果發現，在滑膜肉瘤中差異表達的基因參與Notch、Hh和Wnt等信號通路，其中NOTCH-1和JAG1 明顯上調。本研究結果與其一致，滑膜肉瘤細胞SW982中NOTCH-1及其下游基因HES-1、HES-5和HEY-1表達明顯高于人源滑膜細胞，提示Notch信號通路在滑膜肉瘤細胞處于激活狀態。

圖4 DAPT抑制SW982細胞的增殖和侵襲Fig.4 The proliferation and invasion of SW982 cells were downregulated by DAPT

本研究通過慢病毒轉染技術上調和下調Notch信號通路，結果顯示，下調Notch信號通路后SW982細胞增殖及遷移明顯受到抑制，而上調得到的結果完全相反。磷酸酶及張力蛋白同源的基因 （phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10，PTEN） 作為抑癌基因發生突變，其與 Notch 通路的關系在多種腫瘤中得到證實。如在乳腺癌中，Notch信號通路通過下調PTEN表達水平，導致ERK1/2信號轉導的過度激活，從而參與曲妥珠單抗耐藥［11］；而在胃癌中，通過抑制Notch信號通路，可上調PTEN活性，從而誘導胃癌G2/M細胞周期阻滯［12］。本研究發現，滑膜肉瘤中NOTCH-1上調，推測其可能導致PTEN基因的降低，從而發揮腫瘤促進作用。

Notch 信號通路無須第二信使，γ-分泌酶抑制劑能夠靶向阻斷活化的 Notch 受體從胞膜脫落，抑制下游靶基因激活［13-14］。在非小細胞肺癌移植瘤的模型中發現， γ-分泌酶抑制劑能夠有效抑制腫瘤生長，且停藥后仍然發揮著抗腫瘤作用［15］。同時，研究［16］也證實γ-分泌酶抑制劑對于軟組織肉瘤具有抑制作用，如γ-分泌酶抑制劑可減少硬纖維瘤細胞的遷移和侵襲，并可導致其細胞周期阻滯，一項I期臨床試驗表明γ-分泌酶抑制劑用于硬纖維瘤患者中，可取得較好的療效［17］。本研究發現，滑膜肉瘤中Notch 通路被過激活，因此，推測其抑制劑也可能對滑膜肉瘤發揮抑制效果。為了進一步檢測γ-分泌酶抑制劑對于滑膜肉瘤的抑制效果，本研究采用DAPT處理SW982細胞，結果發現其增殖受到明顯抑制。隨后對Notch信號通路是否能影響SW982細胞遷移進行研究，與設想一致，DAPT處理SW982細胞48 h后，SW982遷移能力同樣明顯被削弱。上述結果高度提示Notch信號通路在滑膜肉瘤細胞SW982中扮演促進腫瘤發生發展的角色。

盡管如此，本研究仍具有一定局限性。第一，未能將Notch信號通路抑制劑與臨床化療藥物聯合應用觀察對滑膜肉瘤細胞SW982的影響；第二，Notch信號通路是否能影響滑膜肉瘤細胞SW982體內的增殖和侵襲能力未知，需要后續的動物實驗繼續探究；第三，Notch 本身受體及配體類型較多，本研究證實，NOTCH-1在滑膜肉瘤的增殖侵襲中發揮重要作用，但與之相關的配體尚需進一步研究。相信隨著 Notch 分子生物學的進一步研究，將為包括滑膜肉瘤在內的軟組織腫瘤的診斷和治療提供新思路和實驗依據。