miR-15b-5p靶向CDK4抑制脈絡膜黑色素瘤細胞增殖

張曉楠，馮浩，白雪，應曼曼，孫勝男，寧宏

（中國醫科大學附屬第一醫院眼科，沈陽 110001）

脈絡膜黑色素瘤是成人最常見的原發性眼內惡性腫瘤，具有高轉移率和死亡率，超過90%的患者會發生肝轉移，平均生存時間為7個月。作為黑色素瘤中最致命的一類，脈絡膜黑色素瘤患者即使接受過治療，仍然有約50%會發生轉移，10年生存率約為50%［1-3］。視力喪失是脈絡膜黑色素瘤的主要危害之一，超過1/3的患者需要摘除眼球［4］。脈絡膜黑色素瘤的早期診斷和治療是提高患者生存率的關鍵。對脈絡膜黑色素瘤發生發展機制的深入研究將有助于發現新的診斷和治療方法。

腫瘤的發生常表現為失控性的細胞增殖。細胞周期依賴性激酶 （cyclin-dependent kinases，CDKs） 連續地激活和抑制則是增殖調控的關鍵因素。眾多研究表明，P16-cyclinD-CDK4/6-RB 通路在脈絡膜黑色素瘤的發生發展中起著重要的作用，但探討CDK4與脈絡膜黑色素瘤細胞增殖的研究卻鮮有報道。同時，多種微小RNA （microRNAs，miRNAs） 也被證實與脈絡膜黑色素瘤密切相關。miR-15b-5p是一種與腫瘤發生發展相關的miRNA，它能夠與靶基因mRNA的3’UTR區結合，通過抑制靶基因的表達發揮功能，且它在多種疾病中發揮的生物學功能不盡相同。目前尚未見關于miR-15b-5p調節脈絡膜黑色素瘤細胞增殖的報道。

因此，本研究從關鍵基因CDK4入手，參考miRNAs調控機制，檢測miR-15b-5p與CDK4的靶向調控作用，進而探究miR-15b-5p在脈絡膜黑色素瘤細胞惡性增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 雙熒光素酶報告檢測

將miR-15b-5p與CDK4 3’UTR結合區域的野生型 （WT） 序列和突變型 （MT） 序列插入至pMIR-REPORT熒光素酶質粒中，合成pMIR- REPORT Luciferase-CDK4-3’UTR （WT） 和pMIR- REPORT Luciferase-CDK4-3’UTR （MT） 2種質粒，用海腎熒光素酶質粒pmirGLO作為對照 （以上質粒由和元生物公司合成提供） 。將細胞分為4組： （1） WT+nc組，共轉染CDK4 3’UTR野生型質粒與negative control RNA； （2）WT+mi組，共轉染CDK4 3’UTR野生型質粒與mir-15b-5p mimics； （3） MT+nc組，共轉染CDK4 3’UTR突變型質粒與negative control RNA； （4） MT+mi組，共轉染CDK4 3’UTR突變型質粒與miR-15b-5p mimics。在質粒和RNA共轉染293T細胞72 h后，使用雙熒光素酶報告檢測試劑盒 （美國Promega公司） 檢測熒光強度。

1.2 細胞培養與轉染

人眼侵襲性脈絡膜黑色素瘤細胞系MUM-2B購自上海拜力生物技術有限公司，在含有5%CO2的37℃培養箱中使用含10%的胎牛血清的MEM培養基（美國HyClone公司） 培養。microRNA negative control（nc） ，miR-15b-5p mimics，microRNA inhibitor nc，miR-15b-5p inhibitor由蘇州吉瑪基因公司合成。使用lipofectamineTM3000 （美國Life Technologies Corporation公司） 轉染RNA。將上述RNA和lipofectamine3000分別與無血清培養基混合，再將2種混合物相互混合，靜置15 min，加入到更換新鮮培養基的細胞中。

1.3 實時熒光定量PCR

使用總RNA提取試劑盒 （miRcute miRNA Isolation Kit，北京天根生化科技有限公司天根） 提取總RNA；使用微量分光光度計 （英國BioDrop公司） 檢測RNA的質量和純度；使用miRNA PCR試劑盒 （Hairpin-itTMmicroRNA and U6 snRNA Normalization RTPCR Quantitation Kit，蘇州吉瑪基因公司） 完成反轉錄和qRT-PCR；使用PCR儀 （LightCycler 480Ⅱ，瑞士Roche 公司） 檢測熒光。采用2-ΔΔCt法分析結果。以上操作均按照各自試劑操作手冊進行。

1.4 Western blotting

使用RIPA 裂解緩沖液 （上海碧云天生物技術公司） 提取總蛋白，使用BCA蛋白檢測試劑盒 （上海碧云天生物技術公司） 檢測蛋白濃度。以每孔20 μg蛋白上樣，10% SDS-PAGE電泳，將蛋白轉印至PVDF膜 （美國BIO-RAD公司） ，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入CDK4抗體 （1︰1 000，ab108357，美國Abcam公司）和GAPDH抗體 （1︰5 000，5174s，美國Cell Signaling Technology公司） 于4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，于37 ℃孵育二抗 （ZB-2301，山羊抗兔1︰5 000，北京中山金橋生物技術有限公司） 1 h。使用ECL試劑 （美國Pierce公司） 在發光儀MicroChemi4.2 （以色列DNR公司） 上檢測條帶的熒光亮度。

1.5 CCK-8細胞增殖實驗

采用CCK-8試劑盒（ 日本Dojindo公司） 檢測細胞增殖能力。將轉染24 h后的細胞接種于96孔板中（3×103/孔） ，分別于0、24、48和72 h每孔加入混合有10 μL CCK8試劑的100 μL培養基，于37 ℃孵育2 h后，使用酶標儀（ Model 680，美國Bio-Rad公司） 檢測450 nm波長吸光度（ optical density，OD） 值。

1.6 細胞周期檢測

細胞轉染12 h后更換新鮮培養基，再培養48 h后用胰酶消化收集細胞，使用PBS重懸細胞并用70%乙醇固定24 h。檢測前每管細胞用500 μL PI/RNase常溫避光染色30 min。使用流式細胞儀FACSCalibur （美國BD公司） 檢測。使用cellQuest Pro分析檢測結果。

1.7 統計學分析

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析與作圖。每個結果重復3次。使用兩樣本t檢驗比較2組數據。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-15b-5p與CDK4的結合情況

利用生物信息學網站Targetscan 7.0進行分析，發現miR-15b-5p的種子序列與CDK4的3’UTR區域含有匹配的區段。使用雙熒光素酶報告實驗驗證二者具有直接結合的位點及結合能力 （結合序列見圖1A） 。4組細胞熒光素酶相對活性結果如圖1B所示，WT+mi組熒光素酶活性 （0.880 7±0.025 67） 明顯低于WT+nc組 （1.141 0±0.033 69） ，差異有統計學意義 （P < 0.01） 。而MT+nc組與MT+mi組的熒光素酶活性（0.980 7±0.048 09，0.968 0±0.0268 9），則無統計學差異 （P = 0.696 4） 。

圖1 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-15b-5p與CDK4 mRNA的3’-UTR區域直接結合Fig.1 Dual-luciferase assay result showed that CDK4 was a direct target of miR-15b-5p

2.2 miRNA的轉染效率

通過實時熒光定量PCR檢測miR-15b-5p表達水平。如圖2所示，mimics組miR-15b-5p的相對表達量為nc組的389.3% （P < 0.000 1） ，提示轉染mimics能有效增加miR-15b-5p表達水平；同時，inhibitor組miR-15b-5p的相對表達量為inhibitor nc組的3.166%（P < 0.000 1） ，提示轉染inhibitor能有效減低miR-15b-5p表達水平。

圖2 實時熒光定量PCR檢測miR-15b-5p表達水平Fig.2 The expression level of miR-15b-5p detected using QRT-PCR

2.3 CDK4蛋白的表達量

通過Western blotting檢測CDK4蛋白的表達量，結果如圖3所示，與nc組相比，mimics組CDK4蛋白條帶的相對灰度值升高（0.610±0.079），差異有統計學意義 （P < 0.01） ；與inhibitor nc組相比，inhibitor組CDK4蛋白條帶的相對灰度值降低（1.331±0.099），差異有統計學意義（ P < 0.05） 。

2.4 miR-15b-5p對脈絡膜黑色素瘤細胞增殖的影響

用CCK-8實驗測定細胞增殖能力，結果如圖4所示，轉染72 h時nc組與mimics組的相對OD值分別為2.486±0.075 19和1.671±0.044 61，差異有統計學意義 （P < 0.001） ，與nc組相比，mimics組細胞的增殖能力下降；細胞轉染72 h時，inhibitor nc組與inhibitor組的相對OD值分別為3.300±0.095 89和4.513±0.189 20，差異有統計學意義 （P < 0.01） ，與inhibitor nc組相比，inhibitor組細胞的增殖能力升高。

圖3 Western blotting檢測CDK4蛋白表達量Fig.3 The expression level of CDK4 detected by Western blotting

圖4 CCK-8檢測miR-15b-5p對脈絡膜黑色素瘤細胞增殖的影響Fig.4 The effect of miR-15b-5p on the proliferation of choroidal melanoma cells detected by CCK-8

2.5 miR-15b-5p對脈絡膜黑色素瘤細胞周期的影響

使用流式細胞術檢測各組細胞周期情況。如圖5所示，mimics組細胞G1期的比例［（ 81.79±0.750 2） %］較nc組［ （ 75.98±0.499 7） %］增加，差異有統計學意義（P < 0.01） ；inhibitor組細胞G1期比例［（ 70.82±1.013 0） %］較inhibitor nc組［（ 76.36±0.978 4） %］減少，差異有統計學意義（ P < 0.05） 。

3 討論

脈絡膜黑色素瘤的發生存在多種機制，如基因突變、染色體缺失或易位以及信號通路的異常激活等。研究［5-8］發現，脈絡膜黑色素瘤中，p16的甲基化失活較為常見，cyclin D1呈高表達，促進CDK4磷酸化Rb；Rb的磷酸化可以釋放轉錄因子E2F1，促進細胞周期從G1期向S期推進，進而促進細胞的惡性增殖。這些證據都表明，p16-cyclinD-CDK4/6-RB通路與脈絡膜黑色素瘤的發生發展密切相關。CDK4作為通路中的核心分子，很有可能發揮了重要的作用。雖然一些關于遺傳易感性的研究［9-10］發現脈絡膜黑色素瘤中沒有CDK4的可遺傳突變發生，但這并不能排除包含miRNA機制在內的一些表觀遺傳學機制參與CDK4對脈絡膜黑色素瘤發生發展調節的可能性。

圖5 流式細胞術檢測miR-15b-5p對脈絡膜黑色素瘤細胞周期的影響Fig.5 The effect of miR-15b-5p on the cell cycle of choroidal melanoma cells detected by flow cytometry

miRNA是一類長約22個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA分子，其功能是與靶基因mRNA的3’UTRs互補性結合，從而反向調控靶基因的表達。目前發現異常的miRNA表達與包括癌癥在內的許多疾病有關，而功能實驗顯示miRNA既可以作為抑癌基因，也可作為癌基因發揮作用［11］。研究［12-13］表明，miRNAs在脈絡膜黑色素瘤患者的血清、玻璃體和腫瘤標本中都存在異常表達，許多miRNAs的生物學作用也進一步被驗證［14-16］。因而miRNAs在脈絡膜黑色素瘤進程中起著重要的作用。

本研究將人眼侵襲性脈絡膜黑色素瘤細胞系作為研究對象，通過體外實驗探討miR-15b-5p靶向CDK4抑制脈絡膜黑色素瘤細胞增殖的作用。雙熒光素酶報告實驗證明，CDK4是miR-15b-5p的直接靶點。在脈絡膜黑色素瘤細胞系MUM-2B中轉染4組miRNA （nc，miR-15b-5p mimics，inhibitor nc，miR-15b-5p inhibitor） ，實時熒光定量PCR結果證實轉染有效，Western blotting結果證明miR-15b-5p能夠負向調節CDK4的蛋白表達。上述結果共同證明在脈絡膜黑色素瘤細胞系中miR-15b-5p能夠靶向抑制CDK4的表達。應用CCK-8進一步對細胞增殖能力進行檢測，結果表明miR-15b-5p能夠抑制脈絡膜黑色素瘤細胞增殖。流式細胞術結果證明，miR-15b-5p能夠造成脈絡膜黑色素瘤細胞發生G1期阻滯。這一結果與p16-cyclinD-CDK4/6-RB通路主要在G1期發揮作用的理論一致。以上結果共同證明了miR-15b-5p能夠通過調節CDK4的表達，抑制p16-cyclinD-CDK4/6-RB通路，進而抑制脈絡膜黑色素瘤細胞增殖。

miR-15b-5p已被報道與多種腫瘤的發生發展相關，但其發揮的生物學功能卻不盡相同。一方面，miR-15b-5p作為腫瘤的抑制因子發揮著多種作用，如誘導細胞死亡、抑制增殖、拮抗轉移、重新調節代謝、破壞染色體穩定性、誘導腫瘤相關炎癥等［17-18］。另一方面，miR-15b-5p又扮演促癌角色，與皮膚黑色素瘤的發生和不良預后相關［19］，且復發患者的血清miR-15b-5p的水平隨時間顯著升高［20］。miRNA在腫瘤中的具體作用與其靶基因密切相關，即使相同的miRNA作用于不同的靶基因也有可能呈現出完全不同的生物學功能。雖然脈絡膜黑色素瘤與皮膚黑色素瘤有許多相似之處，但其中深入的發生發展機制仍有可能存在巨大的差別。本研究證明miR-15b-5p在脈絡膜黑色素瘤中通過調控CDK4的表達而發揮抑癌作用。

綜上所述，本研究發現miR-15b-5p可靶向調節CDK4在脈絡膜黑色素瘤細胞系MUM-2B細胞中的表達，從而抑制脈絡膜黑色素瘤細胞的生長。為探索脈絡膜黑色素瘤的分子治療靶點提供了實驗依據，為脈絡膜黑色素瘤的治療提供了一種新的可能。