EGCG促進AOM/DSS誘導小鼠結直腸腺瘤生成

劉剛，周建平，李新，董明

（中國醫科大學附屬第一醫院胃腸外科/疝與腹壁外科，沈陽 110001）

結直腸癌 （colorectal cancer，CRC） 是全球第三大常見癌癥，每年約有120萬新發病例，約有60萬人死于該?。?］。炎性腸病包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎，主要以慢性腸道炎癥為特征，常常導致腹痛、腹瀉和便血［2］。結腸炎相關性結腸癌在炎性腸病患者中具有較高的發病率，這類腫瘤不同于無炎癥結腸中散發腫瘤，其死亡率更高［3］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯 （epigallocatechin gallate，EGCG） 是兒茶素的一種，近期有研究［4］顯示EGCG具有抑制CRC細胞增殖的作用，WUBETU等［5］的一項研究顯示，EGCG能夠通過抑制p-AKT、Nek2蛋白活性，調節AKT通路誘導結腸癌細胞死亡，而GUAN等［6］的研究證實EGCG并無抗腫瘤作用，而且高劑量的EGCG還會促進腫瘤發生。高毒致癌物氧化偶氮甲烷 （azoxymethane，AOM） 聯合致炎劑葡聚糖硫酸鈉 （dextran sulfate sodium，DSS） 構建小鼠潰瘍性結腸炎模型或結腸炎相關性CRC模型已有報道［7-8］。本研究通過AOM/DSS方式在短時間內誘導小鼠結直腸腫瘤生成，并給予EGCG干預，觀察其對小鼠腫瘤發生的影響，進一步通過免疫組化檢測AOM/DSS和AOM/DSS+EGCG處理的小鼠結直腸組織中CD31和CD68的表達，并探討EGCG在結直腸腫瘤發生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只5周齡雌性BALB/c小鼠 （北京維通利華實驗動物技術有限公司） 于中國醫科大學實驗動物部隔離檢疫，適應性飼養1周。飼養環境：溫度 （25±2）℃；濕度 （50±5） %；照明12 h、黑暗12 h交替。將小鼠隨機分為對照組、AOM/DSS組和AOM/DSS+EGCG組，每組10只。

1.2 實驗材料

AOM （美國Sigma公司） ；DSS （美國MP生物醫學公司） ；EGCG （上海麥克林生化科技有限公司） ；CD31抗體 （英國Abcam公司） ；CD68抗體 （美國NOVUS公司） ；即用型免疫組化超敏試劑盒、檸檬酸組織抗原修復液以及PBS磷酸鹽緩沖液 （福州邁新生物技術開發有限公司） 。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立：實驗起始時AOM/DSS組和AOM/DSS+EGCG組小鼠腹腔注射0.1% AOM （10 mg/kg） ，對照組小鼠腹腔注射生理鹽水 （10 mg/kg） 。普通飲用水飼養1周；第2周AOM/DSS組和AOM/DSS+EGCG組小鼠給予2% DSS飲用水喂養；第3、4周AOM/DSS+EGCG組小鼠給予0.01% EGCG飲用水喂養，AOM/DSS組用普通飲用水喂養。AOM/DSS組以1周DSS+2周普通飲用水為一個循環，AOM/DSS+EGCG組小鼠以1周DSS+2周EGCG為一個循環，每組重復3個循環后繼續普通飲用水喂養3周。對照組不做處理，全程普通飲用水喂養。實驗起始后每天觀察小鼠攝食量、飲水量、生命狀態和死亡情況，每周記錄小鼠體質量變化。

1.3.2 標本采集和診斷：第13周末將3組小鼠以CO2法處死，解剖分離小鼠回盲部至肛門整條腸管，延縱軸剖開，觀察腸黏膜損傷程度和腫瘤生成情況，記錄息肉及腫瘤的數量及大小。取材大腸后置于10%福爾馬林溶液中固定，常規石蠟包埋，切片，HE染色。組織學改變由專業病理學醫生診斷。

1.3.3 免疫組織化學：采用SP法，將組織切片常規脫蠟和水化，檸檬酸抗原組織修復液高壓修復，內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育20 min，動物非免疫血清室溫孵育20 min，滴加鼠抗人CD68單克隆抗體或鼠抗人CD31抗體，4 ℃過夜后酶標二抗室溫孵育1 h，鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶室溫孵育1 h后DAB法顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，自來水反藍，乙醇脫水，封片。

1.3.4 微血管密度 （microvessel density，MVD） 和巨噬細胞計數：由CD31染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇，可以被認為是單獨的血管。按照WEIDNER［9］報道的方法，在3個隨機高倍視野中檢查每個區域微血管的最大數量，取其平均值即為MVD，MVD可間接反映CD31的表達情況。CD68主要表達在巨噬細胞的細胞質中，CD68陽性的巨噬細胞呈棕褐色，在5個隨機的高倍視野中計數，取其平均值作為最終巨噬細胞數，可以用巨噬細胞的數量反映CD68的表達情況。

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行分析，計量資料的比較采用單因素方差分析，計數資料的比較采用χ2檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般情況和體質量變化

對照組小鼠在整個實驗過程中飲食、排便正常。AOM/DSS組與AOM/DSS+EGCG組小鼠在進入第1個循環周期后精神狀態逐漸萎靡，進食較對照組少。進入第2個循環周期后，AOM/DSS+EGCG組小鼠死亡1只，解剖見腸脹氣明顯，應為急性腸炎伴梗阻。進入第3個循環周期，AOM/DSS+EGCG組小鼠出現血便。實驗起始時對照組、AOM/DSS組、AOM/DSS+EGCG組小鼠體質量比較均無統計學差異 （P >0.05） 。實驗開始后每周測量小鼠體質量，對照組小鼠體質量穩定增長，AOM/DSS組與AOM/DSS+EGCG組小鼠體質量增長較慢，而且AOM/DSS+EGCG組小鼠在飲用DSS后體質量下降，停止飲用后體質量又再次升高，見圖1。實驗結束時AOM/DSS組小鼠平均體質量較對照組小鼠輕 （P < 0.05） ；AOM/DSS+EGCG組小鼠與對照組小鼠比較平均體質量有統計學差異 （P < 0.01） ，但與AOM/DSS組小鼠比較無統計學差異 （P > 0.05） 。見表1。

2.2 EGCG促進AOM/DSS模型成瘤

圖1 小鼠每周體質量變化Fig.1 The body weight of mice was measured every week

對照組小鼠無成瘤或炎癥反應；AOM/DSS組10只小鼠中5只出現結直腸非典型增生，其中4只出現腺瘤，1只出現不典型增生，癌變率為50.00% （5/10） ，與對照組比較癌變率的差異有統計學意義 （P < 0.05） ；AOM/DSS+ EGCG組9只小鼠中6只出現結直腸非典型增生，其中4只出現腺瘤，癌變率為66.67% （6/9） ，與對照組比較癌變率的差異有統計學意義 （P < 0.01） ，但與AOM/DSS組比較癌變率的差異無統計學意義（P > 0.05） 。EGCG雖然沒有明顯增加小鼠結直腸腺瘤成瘤率，但AOM/DSS+ EGCG組成瘤小鼠腫瘤數量明顯多于AOM/DSS組 （P < 0.05） 。見表2。

表1 第13周末小鼠體質量和腫瘤發生情況Tab.1 The body weight of mice and the incidence of colorectal cancer at the end of week 13

表2 AOM/DSS組和AOM/DSS+EGCG組小鼠結直腸腺瘤數量、CD31標記的MDV和CD68+巨噬細胞數量比較Tab.2 Comparison of the number of colon adenomas，MVD for CD31，and the number of CD68+ macrophages in the AOM/DSS and AOM/DSS+EGCG groups

2.3 小鼠結直腸組織病理比較

在第13周末處死小鼠，解剖肉眼可見對照組小鼠結直腸組織紅潤，無潰瘍出血，無肉芽腫形成；AOM/DSS組與AOM/DSS+EGCG組小鼠結直腸組織明顯充血水腫，在結腸遠端和直腸部位較結腸近端具有更多的腫瘤負荷。組織學上，對照組小鼠腺體結構正常，無黏膜潰瘍；AOM/DSS組小鼠的含瘤結直腸組織中觀察到隱窩破壞、黏膜表面潰瘍及中性粒細胞浸潤；AOM/DSS+EGCG組小鼠的含瘤結直腸組織除了黏膜破壞、中性粒細胞浸潤外，腺體更加紊亂，瘤細胞異型性明顯。見圖2。

2.4 CD31和CD68在AOM/DSS組和AOM/DSS+EGCG組小鼠結直腸腺瘤中的表達

CD31陽性的腫瘤微血管呈棕黃色，均勻分布于結直腸腺體之間。AOM/DSS+EGCG組小鼠腫瘤中MDV值明顯高于AOM/DSS組。CD68主要標記巨噬細胞的細胞膜，AOM/DSS+EGCG組小鼠其生成腫瘤間巨噬細胞數量明顯高于AOM/DSS組，差異有統計學意義 （P < 0.05） 。見圖3、表2。

3 討論

CRC起源于結直腸的上皮細胞，是世界第三高發腫瘤。在炎性腸病患者中，潰瘍性結腸炎是結直腸惡變的一個主要危險因素，已有研究［10］表明慢性炎癥在結腸中的促腫瘤作用。潰瘍性結腸炎到CRC的發展通過多種機制演變，主要包括氧化應激和轉錄激活子3信號通路的活化等［11-12］。 然而，用于預防炎癥腸疾病導致CRC的有效藥物還未問市。因此，建立炎癥相關性小鼠CRC模型，對于研究CRC進展及藥物研發極具價值。用于誘導CRC的AOM/DSS模型［13］基于腹腔注射AOM，然后在飲用水中加入DSS重復喂養小鼠，其中 DSS誘導結直腸明顯炎癥，從而促進CRC的形成。

圖2 小鼠結直腸肉眼所見和結直腸組織病理圖片 HE×100Fig.2 Gross appearance and microscopic findings of the colons in mice HE×100

圖3 CD31和CD68在小鼠結直腸腫瘤組織中的表達情況 CD31×200，CD68×400Fig.3 CD31 and CD68 expression in murine colon adenoma CD31×200，CD68×400

血管生成在CRC的發展過程中起重要作用，小鼠息肉病模型已經表明息肉生長減少與新微血管形成的衰減有關［14］。典型的抗腫瘤藥物貝伐單抗通過抗體與人血管內皮生長因子結合，阻斷其活性來抑制血管生成，從而達到抗腫瘤的作用。有研究［15］認為可以將CD31同血管內皮生長因子一起用于評估腫瘤血管生成，將測出的MVD值作為CRC的一個預后因素。內皮細胞增生以及異常血管生成在由正常組織向腺瘤轉變繼而演發成惡性過程中起到推波助瀾的作用，內皮細胞標志物CD31可以標記腫瘤旁微小血管。本研究通過MVD定量評估腫瘤血管生成［16］。MOHAMED等［17］對50例CRC患者的臨床病理學參數進行分析，得出CD31高表達組的患者總體生存率顯著低于CD31低表達組 （P = 0.023） 。本研究中，AOM/DSS+EGCG組的小鼠結直腸腫瘤中CD31的表達明顯高于AOM/DSS組，其與腫瘤生成的數量有一定相關性。

腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤進展中也起到重要作用，具有高水平巨噬細胞浸潤腫瘤組織的患者預后較差［18］。CD68于巨噬細胞的細胞膜和細胞質中表達，在正常組織中CD68陽性細胞主要位于上皮細胞層之外，而在腫瘤組織中這些細胞可在上皮腫瘤細胞之間觀察到［19］。在炎癥的刺激下，不僅細胞因子和血管成長因子增多，整個機體的免疫微環境也在發生變化。巨噬細胞在炎癥和癌癥中也具有不可或缺的作用，激活的巨噬細胞可以產生特定的功能，既能促炎又能抗炎，這些機制依賴于巨噬細胞在特定微環境中獲得的極化表型。有研究［20-21］表明M2型巨噬細胞在CRC起始的生長和轉移中具有關鍵作用，而且M2型巨噬細胞還與腫瘤遷移/侵襲相關因子 （如白細胞介素-10、腫瘤壞死因子） 的異常增多有關。M2型巨噬細胞的典型特征是高度生成趨化因子，包括CCL17、CCL22或CCL24等，使調節性T細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞聚集，產生大量白細胞介素-10，導致免疫監視功能削弱，甚至促進組織重塑和血管生成。CD68作為巨噬細胞表面分子標志物，可通過其表達檢測腫瘤組織中巨噬細胞數量，進而研究其與腫瘤發生發展的關系。本研究中，AOM/DSS+EGCG組小鼠的結直腸腫瘤中CD68的表達明顯高于AOM/DSS組，其與腫瘤生成的數量呈正相關。

HARATIFAR等［4］發現EGCG能夠抑制HT29結腸癌細胞系的增殖，還有研究［9］證實EGCG能夠通過抑制AKT、ERK1/2通路誘導結腸癌細胞凋亡。然而本研究并沒有證實這一點，而是發現EGCG在沒有降低造模小鼠結直腸腫瘤發生率的前提下，反而增加腫瘤發生的數量。這與GUAN等［6］報道的結果相一致，他們的結果還顯示高劑量的EGCG加重小鼠結直腸癌變的程度。盡管EGCG在CRC進展中的作用機制和對人類的意義有待進一步調查，但對于服用高劑量綠茶多酚補充劑的人群，尤其是結腸炎癥患者，可能需要格外注意。

綜上所述，AOM/DSS是構建小鼠結直腸腺瘤模型的一種短期有效方法，口服EGCG增加了AOM/DSS誘導小鼠結直腸非典型增生的發生率和腫瘤的數量。除此之外，EGCG可能通過促進結腸中慢性炎癥進程和血管生成，進而促進結腸炎相關結直腸腫瘤的發生。