響應曲面法優化馬齒莧中總生物堿的提取工藝△

梁艷妮，李若嵐，唐志書，千磊，張東博，劉世軍，宋忠興，王征

陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心/陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083

馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧PortulacaoleraceaL.的干燥地上部分，為草本藥食同源植物，全國均有分布，具有清熱解毒、涼血止血、止痢作用[1]。臨床常用于熱毒血痢、癰腫疔瘡、丹毒、蛇蟲咬傷、濕疹、便血、痔血、崩漏下血等[2-3]。國內外學者對其化學成分、藥理作用進行研究，馬齒莧主要含有生物堿類、萜類、香豆素類、黃酮類、有機酸類、揮發油及多糖等化學成分，具有抗炎、鎮痛、抑菌、降血脂血糖、抗腫瘤等藥理作用[4-6]。馬齒莧生物堿能有效抑制乳腺癌細胞的增長，調控腫瘤細胞代謝[7]。優化馬齒莧生物堿的提取工藝對于進一步的藥理作用研究具有重要意義。

目前在生物堿提取工藝中使用較多的方法為超聲波法和加熱回流法[8-10]。大部分生物堿難溶或不溶于水，與酸結合后易溶于水和醇，可采用醇類溶劑提取后配合酸水溶解，堿化游離后有機溶劑萃取得到總生物堿。Box-Behnken效應面法將各個因素與響應值之間的函數關系用多項式進行擬合，精確表述因素與響應值的關系[11]。本實驗擬通過單因素試驗與響應面分析法優化馬齒莧總生物堿的乙醇回流粗提取工藝，為其馬齒莧生物堿的分離純化提供參考。

1 材料

UV-2600型紫外分光光度計(日本島津公司)；KQ-300DE型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；GB204型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；FA2004B型萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；VaCo5低溫冷凍干燥儀(Zibrus Technology)；HH-2型恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；FE-1000AD固體粉碎機(天津鑫博得儀器有限公司)。

咖啡因對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq16052505，純度：HPLC≥98%)；所用試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

馬齒莧(批號：20171101，陜西興盛德藥業有限責任公司)為馬齒莧科植物馬齒莧PortulacaoleraceaL.的干燥地上部分，由陜西中醫藥大學王繼濤高級實驗師鑒定。

2 方法與結果

2.1 總生物堿的測定

2.1.1 對照品溶液的配制 參照扈本荃等[12]馬齒莧總生物堿的含量測定，準確稱取咖啡因對照品10 mg，放置于25 mL容量瓶中，加入少量無水乙醇使其溶解后定容，搖勻，備用。

2.1.2 溴甲酚綠緩沖溶液的配制 準確稱取溴甲酚綠0.125 mg，加入250 mL燒杯中，用5%的NaOH溶液12.5 mL使其溶解，再準確稱取鄰苯二甲酸氫鉀2.5 g，加入適量蒸餾水使其溶解后轉移至250 mL容量瓶中，定容后調節pH至4.4，備用。

2.1.3 標準曲線的繪制 準確量取0、1、2、3、4、5、6 mL 2.1.1項下對照品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，分別加入1 mL溴甲酚綠緩沖溶液和2 mL無水乙醇溶液，用蒸餾水定容至刻度線后搖勻放置15 min。以629 nm為測定波長，測定對照品溶液的吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。所得回歸方程為Y=2.607X+0.015 2，r=0.999 5。結果表明，在質量濃度范圍40～240 mg·mL-1線性良好。

2.1.4 供試品溶液的配制 將干燥馬齒莧藥材粉碎，精確稱取馬齒莧粗粉30 g，在考察提取因素條件下(回流時間、回流溫度和料液比)加入95%乙醇于500 mL圓底燒瓶加熱回流提取，保持微沸，共提取2次，抽濾，將濾液合并，回收乙醇后將所得浸膏于燒杯中蒸餾水超聲溶解。用鹽酸調節提取液pH=3～4，攪拌均勻后，轉移至500 mL分液漏斗中，使用乙酸乙酯以體積比為1∶1萃取3次，合并乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯。再將水相用氨水調節pH=10～11，攪拌均勻后，二氯甲烷以體積比1∶1萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，回收二氯甲烷后得馬齒莧總生物堿，精密稱質量。

將提取得到的馬齒莧總生物堿溶于10 mL無水乙醇，定容于25 mL容量瓶中搖勻，備用。按照2.1.3項下方法測定吸光度，根據咖啡因標準曲線計算總生物堿的提取率。

2.2 單因素試驗

2.2.1 回流時間對馬齒莧總生物堿提取率的影響 精確稱取干燥馬齒莧粉末30 g于500 mL圓底燒瓶中，以95%乙醇為提取試劑，固定回流提取溫度為75 ℃，料液比為1∶7，分別考察回流時間為1、1.5、2、2.5、3 h時馬齒莧中總生物堿的提取率，見圖1。

圖1 回流時間對總生物堿提取率的影響

從圖1可以看出馬齒莧中生物堿的提取率隨回流時間的增加先增后減，當回流時間在1～2.5 h時提取率呈現上升趨勢，在2.5 h時達到最大提取率，為0.223%；當回流時間在2.5～3 h時提取率呈現下降趨勢。綜上所述，可確定當回流時間為2.5 h，此時生物堿的得率最高。

2.2.2 回流溫度對馬齒莧總生物堿提取率的影響 精確稱取干燥馬齒莧粉末30 g于500 mL圓底燒瓶中，以95%乙醇為提取試劑，固定回流提取時間為2 h，料液比為1∶7，分別考察回流溫度為70、75、80、85、90 ℃時馬齒莧中總生物堿的提取率，見圖2。

圖2 回流溫度對生物堿提取率的影響

從圖2可知，當回流溫度在70～80 ℃時，馬齒莧中生物堿的提取率呈現上升趨勢，在80 ℃時可達到最大提取率為0.199%；當回流溫度在80～90 ℃時提取率呈現下降趨勢。綜上所述，可確定回流溫度為80 ℃，此時生物堿的得率最高。

2.2.3 料液比對馬齒莧總生物堿提取率的影響 精確稱取干燥馬齒莧粉末30 g于500 mL圓底燒瓶中，以95%乙醇為提取試劑，固定回流提取時間為2 h，提取溫度為75 ℃，分別考察料液比為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10時馬齒莧中總生物堿的提取率，見圖3。

圖3 料液比對生物堿提取率的影響

從圖3可知，當料液比在1∶6～1∶8時生物堿提取率呈現上升趨勢，1∶8時最大提取率為0.204%；當料液比在1∶8～1∶10時生物堿提取率呈現下降趨勢。綜上所述，可確定料液比為1∶8，此時生物堿的得率最高。

2.3 Box-Behnken響應面試驗設計

2.3.1 響應模型建立與分析 根據單因素試驗篩選的提取時間、提取溫度和料液比，采用Design-Expert.V8.0.6軟件中Box-Behnken模型設計試驗組，以回流時間(A)、回流溫度(B)、料液比(C)3個因素為自變量，將馬齒莧總生物堿提取率作為響應值，進行響應面分析。Box-Behnken試驗設計因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平表

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

表3 響應面回歸模型方差分析

注：**P<0.01，差異有統計學意義；*P<0.05，差異有統計學意義。

2.3.2 響應面圖分析與優化 通過多元回歸方程作三維效應曲面圖和二維平面等高線圖，從圖4～6可以直觀分析三個因素之間的交互作用以及對總生物堿提取率的影響。

圖4 提取時間與提取溫度對馬齒莧生物堿提取率的響應面圖和等高線圖

圖5 提取時間與料液比對對馬齒莧生物堿提取率的響應面圖和等高線圖

圖6 提取溫度與料液比對馬齒莧生物堿提取率的響應面圖和等高線圖

由圖4提取時間與提取溫度交互作用顯示，提取時間變化曲面比提取溫度變化曲面陡峭；等高線圖呈橢圓形表明二者交互作用顯著。由圖5提取時間與料液比交互作用顯示，料液比變化曲面比提取時間曲面稍陡峭；等高線圖呈橢圓形表明二者交互作用顯著。由圖6料液比與提取溫度交互作用顯示，料液比變化曲面比提取溫度變化曲面陡峭，二者交互作用不顯著。

2.3.3 驗證實驗 根據響應面分析結果確定回流提取馬齒莧總生物堿的最佳工藝參數為提取時間2 h，提取溫度66.75 ℃，料液比1∶9，在該條件下馬齒莧中總生物堿的提取率可達到0.207%。實際操作調整為提取時間2 h，提取溫度66 ℃，料液比1∶9，驗證實驗得馬齒莧中總生物堿提取率為0.199%，與模型預測提取率十分接近，說明用響應面法優選的提取條件可靠。

2.4 DPPH·清除活性

將提取的馬齒莧生物堿配成質量濃度為1 mg·mL-1的甲醇溶液。移取上述生物堿甲醇溶液2 mL置于100 mL的容量瓶中，甲醇定容，進一步分別稀釋為0.01、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg·mL-1的樣品溶液。

按照陳智坤等[13]清除DPPH·的方法，向6支試管中分別加入2 mL 0.048 mg·mL-1的DPPH·甲醇溶液和2 mL系列濃度的馬齒莧生物堿甲醇溶液，充分混合，室溫避光反應30 min后測定在517 nm處的吸光度A實驗；以等體積的甲醇代替馬齒莧生物堿溶液，同法操作，測定吸光度為A空白。每組平行測量3次，取其平均值。DPPH·清除能力計算公式為：

清除率(%)=(A空白-A實驗)/A空白×100%

(1)

圖7 不同質量濃度馬齒莧總生物堿對DPPH·的清除作用

從圖7可看出馬齒莧生物堿對DPPH·的清除率隨著濃度增大而增強，在0.01～0.20 mg·mL-1呈一定量效關系，當馬齒莧總生物堿質量濃度為0.20 mg·mL-1時清除率達84.40%。

3 討論

在提取工藝參數的優化中，影響因素和響應值之間往往具有高度非線性關系，響應面法通過設計有限次數試驗，建立包括各顯著因素一次項、平方項和交互項的多元二次模型，擬合因素與響應值間的全局函數關系。通過對影響響應值的各因素水平及其交互作用進行優化和評價，快速有效地確定多因素影響的最佳條件，精度高，預測性好。本研究在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken效應面法設計試驗并進行馬齒莧總生物堿的回流提取工藝優化，建立的二次多項回歸模型極顯著，失擬項不顯著，擬合度好，能夠準確地反映萃取前95%乙醇回流提取時料液比、提取時間和提取溫度對馬齒莧總生物堿提取率的影響。利用此模型得到的馬齒莧總生物堿乙醇回流提取最佳條件為料液比1∶9，提取時間2 h，提取溫度66 ℃，生物堿提取率為0.207%。由驗證實驗可知，Box-Behnken效應面法得到的理論優化結果與實驗值接近，說明所采用的響應面法優化結果可靠。采用非線性擬合模型接近客觀事實，效應面三維圖使因素對指標的影響更為直觀、方便，實驗精度高。馬齒莧生物堿對DPPH·的清除能力具有濃度依賴性，總生物堿濃度在0.2 mg·mL-1時清除率可達84.40%。有關馬齒莧生物堿的抗氧化活性還需進一步考察。