平臥菊三七提取物抗氧化活性研究與抗氧化特征成分的HPLC-MS/MS分析△

趙玉榮，陸姍姍，朱張新，張培瑞，劉晨，劉俊，何立巍

南京中醫藥大學翰林學院 藥學院，江蘇 泰州 225300

平臥菊三七GynuraprocumbensLour.為菊三七屬多年生草本植物，藥食兼用，多分布于東南亞地區，如馬來西亞、泰國；在我國主要分布于廣東、云南等地。平臥菊三七具有降糖、抗腫瘤、抗氧化等功效[1-3]。研究表明，平臥菊三七中含有多種顯著抗氧化作用的天然成分，如有機酸類、黃酮類以及三萜類成分[4-5]。但目前研究還未明確平臥菊三七中的具體抗氧化成分。由于平臥菊三七中含有的成分復雜，DPPH活性檢測及HPLC-MS/MS技術正越來越多被應用于其活性成分的發現與確證[6-7]。本實驗采用乙醇回流法提取平臥菊三七中活性成分，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取其中的活性成分得到各部位成分，并結合體外DPPH自由基清除實驗篩選各部位的抗氧化活性大小。采用HPLC-MS/MS對抗氧化活性較高的部位進行成分的分析，以便進一步研究平臥菊三七的藥效物質基礎。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫1200系列高效液相色譜儀、6520系列電噴霧-飛行時間質譜(ESI-Q-TOF-MS/MS)；真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司，恒DZF系列)；分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52A)；超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司，KH-500B型)。

1.2 試藥

綠原酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y24J7K16726)；阿魏酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：H27J7L16718)；蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y01D8S49613)；楊梅素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：YM0311YA13)；槲皮素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：20J6Y1722)；咖啡酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110885-201703，質量分數99%)；DPPH(Sigma公司)；甲醇為色譜純；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 平臥菊三七提取物的制備

平臥菊三七藥材購于江蘇省野生蔬菜研究所，由南京中醫藥大學翰林學院中藥鑒定教研室劉晨老師鑒定。取干燥地上部分藥材粉碎，稱取25 g，每次加入10倍量80%乙醇，80 ℃下回流提取1 h，共提取3次，合并提取液并濃縮至終體積為30 mL，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3次，合并萃取液，濃縮，得各部位樣品。

2.2 平臥菊三七各部位清除DPPH自由基能力的測定

對何英杰等[6]的方法進行改良，分別將50 μL質量濃度分別為0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1的平臥菊三七各部位提取物溶液加入96孔板中，然后再加入150 μL質量濃度為0.11 mg·mL-1的DPPH溶液，充分震蕩混合均勻，在室溫避光下靜置10 min。之后，在波長517 nm處測定每孔的吸光度值，記為樣品吸光值A1。陰性對照組中加入50 μL乙醇，測定值為A0，陽性對照藥是維生素C(Vc)，每個試樣做4次平行實驗，取其平均值。自由基的清除率以如下公式計算。

DPPH自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%

(1)

2.3 液相色譜條件

精密稱取平臥菊三七乙酸乙酯部位提取物100 mg，加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，配制成質量濃度為5 mg·mL-1的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，由自動進樣器進樣，進樣量5 μL；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；采用漢邦Kromasil-C18反相色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)，洗脫條件：采用梯度洗脫，0～5 min，10%B；5～25 min，30%B；25～70 min，55%B?；衔镉枚O管陣列檢測器在254 nm的波長下檢測。

2.4 串聯質譜條件

ESI離子源，離子源噴霧電壓： 3.0 kV，霧化器壓力： 0.2 MPa，干燥氮氣(N2)流速：9 L·min-1，干燥氮氣(N2)溫度：350 ℃，掃描范圍為m/z：100～1000，負離子模式掃描。

2.5 數據處理

采用Graphpad Prism 7軟件計算藥物對DPPH自由基清除率的IC50值。

3 結果

3.1 平臥菊三七提取物不同極性部位得率及清除DPPH自由基能力的測定

采用2.1的提取方案，得到石油醚部位0.531 8 g，得率2.1%；乙酸乙酯部位0.084 7 g，得率0.33%；正丁醇部位0.376 5 g，得率1.49%；水部位2.533 0 g，得率10%。按照2.2的方法分別測定平臥菊三七石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物、乙醇提取物在質量濃度0.156～5 mg·mL-1和Vc對DPPH自由基的清除活性，結果表明，在最低質量濃度0.156 25 mg·mL-1下，乙酸乙酯和正丁醇對DPPH的抑制率達到89.17%和62.86%，顯示出較強的清除DPPH自由基活性，不同極性部位清除DPPH自由基的順序為：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>乙醇提取物>石油醚部位>水部位。筆者分別測定了乙酸乙酯部位和正丁醇部位在質量濃度為3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500 μg·mL-1和Vc對DPPH自由基的清除活性，結果見圖1。Vc、乙酸乙酯部位和正丁醇部位的IC50分別是12.19、28.8、321 μg·mL-1，表明乙酸乙酯部位對DPPH自由基清除能力最強，提示乙酸乙酯部位中含有的化學成分可能是平臥菊三七抗氧化的活性成分。因此，我們采用HPLC-MS/MS技術對乙酸乙酯部位的化學成分進行分析。

圖1 平臥菊三七地上部分提取物乙酸乙酯部位和正丁醇部位對DPPH自由基的清除率

3.2 平臥菊三七乙酸乙酯部位化學成分鑒定

通過液質聯用(LC-MS)技術按上述條件對平臥菊三七乙酸乙酯部位成分進行分析，得到254 nm下的液相色譜圖(圖2A)及ESI負離子模式下總離子流圖(圖2B)。通過液質聯用電噴霧四級桿飛行時間質譜儀(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)檢測得到平臥菊三七提取物乙酸乙酯部位各化學成分的保留時間及質譜裂解信息，通過總離子流圖、對照品總離子流圖及相關文獻數據對比分析，對平臥菊三七提取物乙酸乙酯部位的化學成分進行確認，鑒定得到11個化合物，見表1。

注：A.HPLC-PDA圖；B.HPLC-Q-TOF-MS總離子流圖。圖2 平平臥菊三七地上部分液質聯用色譜圖

3.3 根據質譜裂解特征鑒定平臥菊三七提取物乙酸乙酯部位的化學成分

色譜峰1的準分子離子峰為[M-H]-m/z153裂解產生了109、91、81、65、53，符合原兒茶酸的裂解規律，并和文獻報道一致[8]，鑒定化合物1為原兒茶酸。

色譜峰3的準分子離子峰為[M-H]-m/z353裂解產生了191、69等碎片離子峰，和綠原酸對照品裂解規律一致，鑒定化合物3為綠原酸。通過文獻發現[9-10]，植物中多同時存在綠原酸的異構體，其中包含綠原酸、新綠原酸及隱綠原酸，通過對總離子流圖提取353母離子發現，在洗脫時間10～25 min，出現3個綠原酸異構體，結合文獻研究，綠原酸異構體在C18柱的洗脫順序為新綠原酸、綠原酸及隱綠原酸。因此，根據色譜峰的洗脫時間，鑒定化合物2、3、4分別為新綠原酸、綠原酸及隱綠原酸，其裂解規律亦符合文獻報道。色譜峰5的準分子離子峰[M-H]-m/z179裂解產生了135、117、107等碎片離子峰，經與咖啡酸對照品比較，裂解規律一致，故鑒定其為咖啡酸。色譜峰6的準分子離子峰為[M-H]-m/z337裂解產生了191、93、163等碎片離子峰，符合5-O-香豆?？鼘幩岬牧呀庖幝?，并和文獻報道一致[9]，鑒定化合物6為5-O-香豆?？鼘幩?。色譜峰7的準分子離子峰為[M-H]-m/z163裂解產生了191、93、65等碎片離子峰，符合對香豆酸的裂解規律，并和文獻報道一致[8]，鑒定化合物7為對香豆酸。色譜峰8、9、11的準分子離子峰都為[M-H]-m/z515，通過其裂解特征及文獻對照[9]，鑒定為異綠原酸的異構體，其在C18柱洗脫順序為異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C。進一步通過對總離子流圖提取515母離子發現，在洗脫時間38～48 min，出現3個異綠原酸的異構體，結合文獻研究及各峰的裂解規律，鑒定化合物8、9、11分別為異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C。色譜峰10的準分子離子峰為[M-H]-m/z609裂解產生了301、463等碎片離子峰，和蘆丁的對照品裂解規律一致，鑒定為化合物10為蘆丁。

4 討論與結論

本實驗采用乙醇回流法提取平臥菊三七中的活性成分，進一步以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到不同極性部位，采用體外DPPH自由基清除活性實驗篩選出活性部位為乙酸乙酯部位。因而，本實驗室進一步利用HPLC-MS/MS對清除DPPH自由基活性較好的乙酸乙酯部位進行了成分分析，其中鑒定出11個化合物，主要是有機酸類成分，包括綠原酸異構體和異綠原酸異構體，這些成分具有顯著的抗氧化活性，可以判定，綠原酸異構體及異綠原酸異構體等有機酸類物質可能是平臥菊三七提取物抗氧化活性的物質基礎之一，但其中也有正丁醇部位含有的一些黃酮類成分也具有抗氧化活性，還需要進一步研究。