c-di-GMP在低溫好氧顆粒污泥形成過程中的作用

支麗玲,王玉瑩,馬鑫欣,衣雪松,王 碩,李 激*

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c-di-GMP在低溫好氧顆粒污泥形成過程中的作用

支麗玲1,2,王玉瑩1,2,馬鑫欣1,2,衣雪松3,王 碩1,2,李 激1,2*

(1.江南大學環境與土木工程學院,江蘇 無錫 214122；2.江南大學江蘇省高校水處理技術與材料協同創新中心,江蘇 蘇州 215009；3.海南大學環境與生態學院,海南 ?？?570228)

在低溫條件下運行好氧顆粒污泥反應器,絮狀污泥顆?；^程中信號分子可通過傳導作用引起各層物質之間的組分變化,通過研究胞外聚合物及污泥相關疏水性的變化規律,并觀察此過程中微生物菌群的群落演替特點,揭示環二鳥苷酸(c-di-GMP)在低溫好氧顆粒污泥形成過程中的變化規律與影響作用.結果表明:接種污泥在顆?；^程中,胞外聚合物含量從48mg/gMLVSS增長至139mg/gMLVSS,其中以TB層蛋白質增長為主,在顆?；^程中,c-di-GMP含量由62mg/gMLVSS增至600mg/gMLVSS,始終影響微生物運動及生物膜形成,促使具備胞外聚合物分泌功能的菌群加快分泌胞外聚合物,促進好氧顆粒污泥的形成.各個階段污泥中微生物種群存在較大差異,在反應器運行初始階段與c-di-GMP合成相關的菌群占據優勢,同時在后期表現出較好的脫氮除磷能力,在低溫條件下好氧顆粒污泥微生物菌群發生演替并最終形成穩定的菌群結構.

c-di-GMP；低溫；好氧顆粒污泥；胞外聚合物；群落演替

好氧顆粒污泥(AGS)具有特殊的生物膜結構,由于好氧顆粒污泥具有沉降性能好、生物量高、污染物去除能力強的優點,在生活污水和富含有毒有害物質的廢水處理中均可發揮重要作用[1].我國南方地區污水處理廠冬季水溫僅有8~12℃,長時間的低溫條件會導致污泥中微生物活性及代謝能力下降,從而導致污水處理效果下降,提高污水處理的難度[2].c-di-GMP是新發現的一類信號分子,由兩分子三磷酸腺苷(ATP)或腺苷二磷酸(ADP)經環化酶作用后形成,可被磷酸二酯酶分解為一個線性分子pApA或者兩分子的磷酸腺苷(AMP)[3],可參與調節多種生理功能,包括細胞分化、細胞運動及生物膜狀態的轉變、產生致病因子等[4-6].c-di-GMP可調控細菌的運動方式,如多細胞群集、單細胞泳動、顫搐運動等[7].因此在好氧顆粒污泥的形成過程中,c-di-GMP可作用于細胞間的信息傳遞,促使微生物根據外部環境的變化進行自我調節.C-di-GMP含量增加會促使具備胞外聚合物(EPS)分泌功能的菌群加快分泌EPS[8],使微生物迅速凝聚面對外界的選擇壓力,通過微生物協同作用[9],進而促進好氧顆粒污泥的形成[10]. Angela等[11]研究發現,c-di- GMP可對污泥EPS的分泌產生重要作用,在顆粒污泥形成過程中投加Ca2+,可以改變顆粒污泥的菌群結構,促進sp和sp.等功能性菌群的生長,因而產生大量c-di-GMP,從而使顆粒污泥分泌較多EPS,形成具有穩定結構的好氧顆粒污泥.

本研究通過觀察低溫條件下絮狀污泥顆?；^程中胞外聚合物及其組分的變化規律,研究c-di-GMP對胞外聚合物產生的影響,揭示低溫污泥顆?；^程中微生物菌群的群落演替特點,闡明c-di-GMP在低溫好氧顆粒污泥形成過程中的變化規律與功能作用.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置與運行

采用內循環序批氣提式反應器(SBAR)在低溫條件下培養好氧顆粒污泥,SBAR反應器有效容積為6.0L,曝氣量約為100L/h.實驗周期為4h,進水60min、曝氣160~170min、沉淀15~5min,排水5min(由于接種污泥沉降性能較差,初始沉降時間設為15min,隨著反應器穩定運行逐漸降至5min),運行溫度10°C,pH值約為7.0,排水比為50%[12].

1.2 接種污泥和試驗污水

接種污泥取自某城市污水處理廠,初始接種污泥濃度約為2000mg/L.試驗污水為人工配水,主要成分如下(mg/L):CH3COONa 625,NH4Cl 400, KH2PO430,K2HPO460, MgO440, CaCl280, EDTA 40, NaHCO3100.并投加微量元素液1mL/L[13],微量元素液成分如下(g/L): FeCl3·6H2O 1.5, H3BO30.15, CuSO4·5H2O 0.03, KI 0.03, MnCl2·4H2O 0.12, Na2MoO4·2H2O 0.06, ZnSO4·7H2O 0.12, CoCl2·6H2O 0.15.

1.3 EPS的提取與測定

取備用樣品10mL,在20kHz,40W的條件下超聲30s,然后在4℃,2000r/min條件下離心15min,收集上清液即為溶解型胞外聚合物(SMP-EPS);沉淀物用緩沖液稀釋到原體積(10mL),加入0.06mL37%的甲酰胺,在4℃的恒溫搖床培養箱輕微搖晃1h之后,將懸浮液在4℃,5000r/min條件下離心15min,收集上清液即為附著型胞外聚合物(LB-EPS);沉淀物用緩沖液稀釋到原體積(10mL),加入4mL 1mol/L NaOH,在4℃的恒溫搖床培養箱輕微搖晃3h之后,放入微量離心管中,在4℃,10000r/min下高速離心15min,收集上清液即為緊密結合型胞外聚合物(TB-EPS); EPS的蛋白質(PN)含量使用考馬斯亮藍法測定[12],多糖(PS)使用硫酸－蒽酮法測定[14].

1.4 c-di-GMP的提取與測定

在-80℃下凍干污泥,取0.2g凍干污泥溶于15mL超純水中,加入15mg溶菌酶使污泥微生物細胞溶解,振蕩15min后于37℃下培養1h;后將樣品置于低溫離心機中,在9000r/min下離心15min,轉移上清液至50mL離心管中,加入2倍體積的無水乙醇,再次振蕩10s后于4℃下培養1h;再次將樣品置于低溫離心機中,在9000r/min下離心15min,取沉淀物于37℃下培養3h,加入3mL超純水后再次振蕩10s;將混合液移至5mL離心管中,在12000r/min下離心10min,最后取1mL上清液,采用HPLC(Aglient,1260)進行測定[15].

1.5 污泥相關疏水性及zeta電位測定

相關疏水性(RH)指的是一個分子與水互相排斥的物理性質,疏水性分子偏向于非極性,因此易溶于中性和非極性溶液.利用微生物粘附碳烴化合物法測定微生物細胞表面相關疏水性[16].

采用zeta電位儀(Nano-Z, Malvern)測定污泥zeta電位[17].

1.6 微生物菌群分析

取一定量的污泥進行基因提取,對污泥樣品中微生物的16S rDNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增后進行變性梯度凝膠電泳分析(DGGE),在2個50mL離心管中分別加入16mL30%和60%變性劑(100%變性劑為7mol/L尿素和40%離子甲酰胺的混合物),之后再依次加入90μL 10%硫酸銨和20μL四甲基乙二胺,混勻后,分別吸入2個注射器中,凝固后沖洗點樣孔,取5μLPCR產物和5μL點樣緩沖液混合均勻后點樣,點樣后的膠板置于60℃ 1x TAE緩沖液中,在150V下電泳6h.電泳結束后,剝膠染色,銀染按Bassam[18]的方法進行.獲得的DGGE圖譜采用UMAX透射掃描儀掃描.

2 結果與討論

2.1 進出水水質及EPS變化規律

在低溫條件下運行SBAR,如圖1所示,接種污泥進入低溫環境后整體去除效能均較差,初期NH4+-N去除率僅約為55%,隨著反應器的穩定運行,對NH4+-N的去除能力顯著升高,出水NH4+-N濃度3mg/L左右,去除效率達到95%左右.且反硝化水平也在反應器穩定運行階段達到了較好的提升,出水NO3--N濃度8mg/L左右.

Fig 1 Variations of N concentrations in influent and effluent

胞外聚合物具有較好的粘附性,因此在絮狀污泥顆?；^程中有助于微生物的吸附與聚集[19].由圖2可知,在顆?；^程中, EPS含量從48mg/ gMLVSS增長至139mg/gMLVSS,其中以蛋白質增長為主,蛋白質增量占EPS總增量的75%以上,蛋白質含量從31mg/gMLVSS增加到107mg/gMLVSS,表明蛋白質類物質為EPS內的主要成分,其在絮狀污泥顆?；^程中發揮重要作用,可維持在低溫條件下好氧顆粒污泥的穩定性[20].在常溫條件下運行好氧顆粒污泥反應器[21],接種污泥顆?；^程中, EPS迅速增長,同樣以蛋白質增加為主,由接種污泥的65mg/gMLVSS增加到好氧顆粒污泥的106mg/ gMLVSS,相較低溫條件下所增長的PN類物質含量較低.隨著反應器的運行,多糖含量從16.5mg/ gMLVSS增加到33mg/gMLVSS,由于多糖物質具有較好的粘附性,因此有助于形成粒徑較大的好氧顆粒污泥.PN/PS在反應器運行的前25d內略有增加,反應器運行至30d后,PN/PS增加至3左右,在30~ 60d內,PN/PS基本維持不變,說明在30d左右好氧顆粒污泥基本成形,具有較好的穩定性.

圖2 EPS及其組分的變化情況

由圖3可知,TB-EPS中PN類的增加最為顯著,從接種污泥的18mg/gMLVSS增加到了80mg/ gMLVSS,SMP-EPS和LB-EPS中PN類物質僅略有增高,增量均不高于5mg/gMLVSS. TB-EPS含量的升高有利于污泥顆?；痆22],因此在反應器運行35d左右后,TB-EPS中PN類物質含量僅略微升高,好氧顆粒污泥基本成型. LB-EPS的物質變化可影響污泥的沉降及脫水性能[23], LB-EPS中PN類物質的升高易形成松散的污泥結構,導致污泥沉降性能較差,本研究中LB-EPS中PN含量基本保持在10mg/ gMLVSS,因此在整體的絮狀污泥顆?；^程中好氧顆粒污泥表現出良好的沉降性能.由圖4可知,絮狀污泥顆?；^程中多糖含量的變化甚微,其變化主要體現在SMP-EPS中PS含量的增長,SMP- EPS中PS含量從反應器運行初期的5mg/gMLVSS增加到13.5mg/gMLVSS,主要由于SMP-EPS中PS類物質在污泥顆粒結構中處于污泥外部或較易脫落的部位,因此在曝氣環境下由于剪切力的作用,易轉化為游離態EPS,從而導致SMP-EPS中的PS含量的上升.

圖3 顆?；^程中蛋白含量的變化

圖4 顆?；^程中多糖含量的變化

2.2 c-di-GMP變化規律及其與EPS的關聯性分析

c-di-GMP作為近年來重點研究的第二信使,在多種微生物協調作用中存在,對生物膜的形成以及微生物的運動均有一定影響[24].如圖5所示,接種污泥中c-di-GMP含量較低,僅為62mg/gMLVSS.隨著反應器的穩定運行,c-di-GMP含量呈現先增加后降低的趨勢.在反應器中出現明顯凝聚體但未形成明顯顆粒時,c-di-GMP含量最高,最高值約為600mg/ gMLVSS.隨著好氧顆粒污泥的逐漸成熟,c-di-GMP的含量減少,最終穩定在270mg/gMLVSS左右,仍明顯高于接種污泥的初始水平.

如圖6所示,低溫條件下好氧顆粒污泥中EPS, PN及PS3者與c-di-GMP含量相關性系數分別為0.95、0.94和0.95.c-di-GMP含量的變化對EPS, PN及PS 3者均具有一定程度的影響.c-di-GMP作為微生物分泌的信號分子,識別第一信使傳遞的信息,作用于下游靶細胞時,直接對分泌EPS的微生物傳遞信息,開啟微生物對環境變化的響應機制[25],蛋白質和多糖是EPS的主要構成物,因此3者含量的變化規律與c-di-GMP的相關性變化趨勢相似.

圖5 顆?；^程中c-di-GMP變化

圖6 c-di-GMP與胞外聚合物相關性分析

由于在好氧顆粒污泥形成過程中TB-EPS變化最為明顯,因此分析在低溫條件下好氧顆粒污泥c- di-GMP含量與TB-EPS的關聯性變化,結果表明TB-EPS中PN,TB-EPS中PS及TB-EPS 3者與c- di-GMP含量相關性系數分別為0.81、0.96和0.96 (圖7).說明c-di-GMP含量的變化與TB-EPS中PN及TB-EPS相關性較強,c-di-GMP含量的上升可促進TB-EPS中TB-EPS中PN的分泌,表明TB-EPS中PN類組分是低溫好氧顆粒污泥形成的重要因素.

圖7 c-di-GMP與TB-EPS相關性分析

2.3 相關疏水性與zeta電位變化規律

圖8 顆?；^程中相關疏水性及zeta電位變化

如圖8所示,污泥的相關疏水性在反應器運行的初始階段快速上升,在40d后趨于穩定,相關疏水性基本維持在60%左右,表明在SBAR運行期間,絮狀污泥通過增加表面疏水性以降低污泥表面自由能,使反應器中顆粒物間結合幾率增加,進而促使微生物聚集體形成[26],疏水性顆粒間吸附能力增強,污泥微生物間更易結合,使好氧顆粒污泥粒徑逐漸變大且更密實.同時在好氧顆粒污泥形成的過程中c-di-GMP含量不斷增加,促進胞外聚合物中蛋白質類物質分泌,疏水性基團隨之增多[27],污泥整體相關疏水性提高,同步促進了低溫好氧顆粒污泥的形成.因此分析了相關疏水性與EPS中PN及TB-EPS中PN的關聯性變化,結果表明,EPS中PN,TB-EPS中PN與相關疏水性相關性系數分別為0.947和0.941(圖9).說明相關疏水性的變化與EPS中PN及TB-EPS中PN相關性較強.此外,在好氧顆粒污泥形成的過程中,污泥表面電荷增多,zeta電位逐漸升高,最后基本維持在-9mV左右,表明在顆粒污泥形成過程中污泥之間靜電斥力減小,內部微生物所形成的小顆粒較不穩定,而使顆粒污泥間相對較易結合,有助于低溫好氧顆粒污泥的形成[28].

圖9 顆?；^程中相關疏水性與EPS中PN及TB-EPS中PN的相關性分析

2.4 微生物種群解析

采用接種污泥與反應器運行第40,80,120d的污泥樣品進行比較,如圖10a所示,接種污泥(0d)由于是在常溫條件下培養,因此其具有較豐富的生物多樣性,微生物種類較為豐富.隨著反應器在低溫條件下的運行,由于部分微生物無法長時間適應低溫環境而被逐漸淘汰,因此反應器運行第40d的污泥樣品中微生物多樣性較少.在反應進行至80d時,一部分由于低溫條件而抑制自身生長及代謝的微生物緩慢適應了低溫環境而得到恢復并逐漸穩定,因此第80及120d污泥樣品中的微生物種類較第40d污泥樣品中更為豐富.由圖10b可知,各個階段污泥中微生物種群存在較大差異,表明在低溫條件下好氧顆粒污泥內部經歷了微生物種群的演替并最終菌群結構趨于穩定.

a: DGGE圖譜; b: 聚類分析

經過對接種絮狀污泥在低溫條件下的顆?；囵B,在接種的絮狀污泥中較常見的條帶4和7所代表的和因在低溫SBAR中底物匱乏而逐漸被淘汰[29-30].在低溫好氧顆粒污泥培養成功后,條帶3,8及13成為此時期的優勢菌群,條帶8序列與菌株相似性高達99%,因其具有極強的耐冷能力而存在于SBAR中,屬于污泥中的優勢菌群[31].條帶13所代表的對低溫具有一定耐受性,但在較長時間的低溫環境下,其生長代謝緩慢,因此在低溫SBAR參數優化和穩定運行過程中被逐步淘汰[32];條帶3所代表的屬于反硝化細菌,處于好氧顆粒污泥的核心部位,與菌屬類似,可利用NO3--N等電子受體進行無氧呼吸,此菌株會過量表達一類N-乙酰葡萄糖胺結合蛋白,此蛋白的表達由信號分子c-di-GMP以核糖開關的方式進行調控[33-35],因此在好氧顆粒污泥形成初期,第40d左右該條帶在污泥菌群中占優勢.條帶9代表的菌屬具有富集PHA及生物聚磷的能力,且其與銅綠假單胞菌高度同源,銅綠假單胞菌中基因為c-di-GMP合成的關鍵基因,基因為c-di-GMP的降解基因,可調節胞內c-di-GMP的濃度進而影響微生物運動、生物膜形成[36],因此其在污泥樣品中成為優勢菌群,促進好氧顆粒污泥的形成與穩定. SBAR運行至第120d時,條帶11和14所代表的和成為優勢菌群,二者分別具有在低溫條件下氧化乙酸鹽和NH4+-N的能力,促進了COD和NH4+-N的去除.條帶2和12所對應的和在第120d污泥樣品中為優勢菌群,其具有在缺氧環境下利用NO3--N為電子受體進行反硝化的功能[37],表明好氧顆粒污泥在低溫條件下仍可對污染物具有良好的去除效能.

3 結論

3.1 在低溫條件下,SBAR培養約30d左右好氧顆粒污泥可初步成型,EPS含量從48mg/gMLVSS增長至139mg/gMLVSS,其中以蛋白質增長為主,TB-EPS中PN含量增加至80mg/gMLVSS,在顆?；^程中發揮重要作用,維持了在低溫條件下好氧顆粒污泥的穩定性.

3.2 在低溫好氧顆粒污泥的形成過程中,絮狀污泥可通過增加表面疏水性從而降低污泥表面自由能,使反應器中顆粒物間結合幾率增加,進而促使微生物聚集體形成,形成穩定的好氧顆粒污泥.

3.3 污泥中c-di-GMP含量由62mg/gMLVSS增至600mg/gMLVSS.在反應器中出現明顯凝聚體但未形成明顯顆粒時,c-di-GMP含量最高,c-di-GMP與TB-EPS相關性較強,在反應器運行初始階段促使具備EPS分泌功能的菌群加快分泌EPS,促進好氧顆粒污泥的形成.

3.4 各個階段污泥中微生物種群存在較大差異,在反應器運行初始階段與c-di-GMP相關的菌群占據優勢并在后期表現出較好的脫氮能力,且好氧顆粒污泥微生物菌群發生演替并最終形成穩定的微生物菌群結構.菌屬可調節胞內c-di-GMP的濃度進而影響微生物運動、生物膜形成,c-di-GMP可調控菌屬對蛋白的表達.

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Effect of c-di-GMP in the formation of aerobic granular sludge at low temperature.

ZHI Li-ling1,2, WANG Yu-ying1,2, MA Xin-xin1,2, YI Xue-song3, WANG Shuo1,2, LI Ji1,2*

(1.School of Environmental and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2.Water Treatment Technology and Technology in Jiangsu Province Materials Collaborative Innovation Center, Jiangnan University, Suzhou 215009, China；3.College of Environment and Ecology, Hainan University, Haikou 570228, China)., 2019,39(4)：1560~1567

Along with the granulation process of floc sludge, signal molecules can lead to the variations of extracellular polymeric substances (EPS). In order to investigate the variations and effects of cyclic diguanylate (c-di-GMP) in the formation of aerobic granular sludge at low temperatures, the correlation analysis was carried out based on EPS, relative hydrophobicity (RH), zeta potential and community succession. The experimental results showed that EPS content increased from 48 to 139mg/g MLVSS during granulation, among which the significant increase was attributed to tightly bound-EPS (TB-EPS). The c-di-GMP content increased from 62 to 600mg/g MLVSS, which resulted in microbial succession and biofilm formation, and further improved the secretion of EPS and the formation of aerobic granular sludge. In addition, notable discrepancies were discovered in the microbial population, and the communities associated with the biosynthesis of c-di-GMP prevailed during the formation of aerobic granular sludge. The community succession was obvious and stable microbial community was eventually formed at low temperature, which was conducive to good performance of nitrogen and phosphorus removal.

c-di-GMP；low temperature；aerobic granular sludge；EPS；community succession

X703.5

A

1000-6923(2019)04-1560-08

2018-09-11

國家自然科學基金資助項目(51408264);國家水體污染控制與治理科技重大專項(2017ZX07202001-004,2017ZX07202001-005)

*責任作者, 教授, liji@jiangnan.edu.cn

支麗玲(1995-),女,江蘇蘇州人,江南大學碩士研究生,主要研究方向為信號分子在好氧顆粒污泥形成過程中的機理解析.