川蔓藻對兩種常見浮游藻類的化感作用

張 欣,盧學強*,王 蘭,韓曉昕,毛海燕

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川蔓藻對兩種常見浮游藻類的化感作用

張 欣1,2,3,盧學強1,2,3*,王 蘭1,2,韓曉昕1,2,毛海燕4

(1.南開大學環境科學與工程學院,天津 300350；2.南開大學天津市跨介質復合污染環境治理技術重點實驗室,天津 300350；3.南開大學天津市環境生物地球化學循環調控技術國際聯合研究中心,天津 300350；4.廈門海石生態環境股份有限公司,福建 廈門 361023)

選取沉水植物川蔓藻與浮游藻類普通小球藻、銅綠微囊藻為研究對象,測定在川蔓藻共培養脅迫下2種藻單獨存在和按1:1(:)混合情況下的光密度、葉綠素a、最大光化學量子產量、相對電子傳遞速率、可溶性糖、丙二醛以及超氧化物歧化酶活性的變化.結果表明:在川蔓藻存在的條件下,普通小球藻、銅綠微囊藻和二者混合藻的生長被快速強烈抑制,抑制率在第6d時達到最大值,分別為80.95%、94.18%和94.01%.3個處理組的光密度值、葉綠素a、可溶性糖及最大光化學量子產量等指標均低于對照組,且隨時間呈明顯的下降趨勢,說明其光合能力逐漸減弱.而丙二醛和超氧化物歧化酶指標在0~6d卻高于對照組,表明可能發生了浮游藻類膜質過氧化過程.

川蔓藻；普通小球藻；銅綠微囊藻；化感作用

水華爆發嚴重影響著水質安全,會引發嚴重的飲用水供給危機[1-2].夏季水華浮游植物優勢種主要為藍藻和綠藻[3-5].銅綠微囊藻()是形成水華的一種典型的有毒藍藻[6],會釋放藍藻毒素和異味物質,不僅會對水生生物包括魚類、水生無脊椎動物、沉水植物、挺水植物、細菌等造成一定的傷害,還會通過向水環境中釋放化感物質威脅到人類的健康[7].普通小球藻()是引起水華的具有代表性的一種綠藻,是北方濱海河流的優勢種類[8].前期研究表明,一些沉水植物會對浮游藻類產生特異性的化感抑制作用[9-10].不同種類的浮游藻類之間也會存在競爭,銅綠微囊藻對小球藻、四尾珊藻等藻類都存在化感抑制作用[11-12].川蔓藻()是一種可在高鹽度水域生長的沉水植物[13-14],同時,川蔓藻對普通小球藻還有明顯的化感抑制作用[8],因而川蔓藻往往是濱海高鹽環境水生態修復或水生態系統重建的必不可少的重要物種[15].水華中一般同時存在藍藻和綠藻.然而,川蔓藻對藍藻以及藍藻和綠藻同時存在下的化感抑制作用以及可能的作用機理研究還相對較少.由于影響植物生長的因素較多[16],本實驗在人工氣候箱內進行,分別研究了川蔓藻共培養對銅綠微囊藻(藍藻)、普通小球藻(綠藻)以及兩個藻種共存時的化感作用以及可能的作用機理.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用普通小球藻(FACHB-8)、銅綠微囊藻(FACHB-524)購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫.實驗所用川蔓藻購自江蘇省興化市龍馬水生植物培育有限公司.實驗開始前,川蔓藻用無菌蒸餾水清洗3次,去除附著的沉積物和無脊椎動物,然后在實驗室內用裝有BG11培養基的10L半透明塑料箱懸浮培養7d,每天換1次水,以適應實驗室環境.普通小球藻與銅綠微囊藻置于人工氣候箱中,光周期12h(L明):12h(D暗),溫度(25±2)℃,相對濕度70%,光照強度(6000±200)Lux,用BG11培養基擴大培養,培養基鹽度為2‰.每天搖動兩次,等待其長到對數生長期且藻類濃度大約至5.5×105cells/mL[17].

1.2 實驗方法

實驗設為3組,分別是A組:川蔓藻+普通小球藻;B組:川蔓藻+銅綠微囊藻;C組:川蔓藻+普通小球藻和銅綠微囊藻(2種藻按1:1(:)比例配置,簡稱混合藻).每組實驗又分別設置對照組(CK)和處理組(TR),川蔓藻(整株)與浮游藻類共同放置于1L錐形瓶中,川蔓藻所占培養基的比例為2%(/).每組實驗設置3個平行.各實驗組組成如表1所示.

表1 實驗組設計

實驗在人工氣候箱中進行,條件設置與浮游藻類擴大培養階段一致,連續培養14d.分別在第0,2, 4,6,8,10,12,14d時定時取樣30mL測定藻液的各項生理指標.每次取樣后向培養瓶中補加30mL的BG11培養基,避免因營養成分缺失對浮游藻類的生長產生影響.

1.3 指標測定及計算

各項生理指標測定方法如表2所示.

光密度值(OD560)代表浮游藻類的生物量,用紫外可見分光光度計560nm處測定吸光度表示.藻類抑制率公式[18]:

式中:IR為抑制率;N為處理組第d藻細胞OD560值;M為對照組第d藻細胞OD560值.

根據邏輯斯締方程d/d=(1-/),設定川蔓藻對藻類的效應作用為E,則藻類在川蔓藻共培養作用下的增長模型[19]為:

式中:為增長率;為種群大小(光密度);為環境容納量或負荷量;E為川蔓藻對藻類的化感作用系數.

式中:為比增長率.

e表示每一天處理組的與對照組的的差值,E以實驗期間所有e的平均數表示[20].

葉綠素含量(Chl-a)是光合速率測定中不可缺少的指標,在光合系統能量的獲取和傳遞中起著重要作用[21].一旦Chl-a的合成被抑制,藻類細胞的繁殖也會被抑制[22].

最大光化學量子產量(v/m)代表浮游藻類光系統Ⅱ(PSⅡ)對激發光能的轉換和耗散效率.相對電子傳遞速率(ETR)反映光合電子的傳遞速度,電子傳遞時刻發生在光系統Ⅰ與光系統Ⅱ的物質與能量轉換之間,影響著碳水化合物和ATP的合成速率.每個樣品取3.5mL放入樣品池中暗反應15min后,用水樣熒光儀測定v/m和ETR.

式中:v是暗適應后的最大熒光產量與最小熒光產量的差值;m是暗適應后的最大熒光產量;0是暗適應后的最小熒光產量;ETR值取光響應曲線中的最大值.

可溶性糖(SC)如葡萄糖、蔗糖等,不僅為浮游藻類的生長發育提供能量和代謝中間產物,而且具有信號功能,是浮游藻類生長發育和基因表達的重要調節因子[23].

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終產物,可與蛋白質、核酸反應,使纖維素分子間的橋鍵松弛,或抑制蛋白質的合成,因此可作為細胞及細胞內膜氧化損傷程度的一種重要生物標志物[23-24].

表2 生理指標測試方法

超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶,能清除藻類細胞內的超氧陰離子自由基O-2,使其轉化為H2O2,減少氧自由基對藻類產生的毒害作用.

1.4 數據處理

采用Origin 7.0軟件進行數據處理和統計分析,用檢驗法方差分析檢測平均數之間的差異(),以<0.05作為差異的顯著性水平.

2 結果與討論

2.1 川蔓藻對浮游藻類生長的抑制效果

如圖1所示,3種情況下,川蔓藻對3種實驗藻類都有明顯抑制作用.這種抑制作用的發生迅速而強烈,并且存在于藻類的整個生長期.

A組:川蔓藻對普通小球藻的抑制率最高達到85.17%,化感系數平均為-0.189.在整個培養過程中處理組的普通小球藻始終沒有出現對數生長期,培養期結束時藻類濃度相對于實驗開始時還有所減少.結合之前的研究,培養基鹽度為3‰川蔓藻種植密度為5g/L時,第4d抑制率為88.86%[8],而鹽度在2‰~3‰之內不會影響川蔓藻和普通小球藻的生長[28-29].

B組:在0~4d對照組濃度在緩慢增加,而處理組在0~2d濃度抑制率為7.45%,在2~6d銅綠微囊藻濃度急劇下降,抑制效應顯著(<0.05),培養液迅速變得清澈,抑制率在第6d時達到最大值94.18%.化感系數平均為-0.196.

C組:混合藻的生長趨勢與銅綠微囊藻類似,抑制率也在第6d時達到最大值94.01%,表明川蔓藻對兩種藻類的抑制效果非常顯著(<0.05),在培養后期,浮游藻類的數量也沒有增加.

對比川蔓藻對普通小球藻和銅綠微囊藻的抑制率以及化感系數可知,川蔓藻對銅綠微囊藻的化感抑制作用強于普通小球藻.

2.2 川蔓藻對浮游藻類Chl-a的抑制效果

如圖2所示,3種浮游藻類的處理組Chl-a含量均低于對照組.

A組:對照組Chl-a含量變化呈現了一個完整的“S”型曲線,而處理組在0~2dChl-a含量降低,說明川蔓藻已經抑制了Chl-a的合成;在2~8d也只出現了緩慢的上升趨勢,說明此間處理組普通小球藻處于適應階段;在8~14dChl-a含量,出現大幅增加,相較于對照組川蔓藻的存在使適應期從2d延緩至8d;在第8d之后普通小球藻Chl-a含量逐漸增加,此時普通小球藻的光密度值也有微小的增加(圖1(a)),說明葉綠素含量的增加促進了普通小球藻的繁殖,化感抑制作用減弱,也證明了普通小球藻對川蔓藻所產生的化感物質具有一定的適應性.

圖2 川蔓藻共培養情況下浮游藻類Chl-a含量的變化

B組:對照組Chl-a含量在培養期間增加迅速,而處理組在0~4d幾乎沒有增加,在4~6d含量迅速下降,表明川蔓藻產生的化感物質對Chl-a有強抑制效應.Chl-a的減少使得銅綠微囊藻不但無法繁殖而且大量死亡,與圖1(a)情況相吻合.在6~14dChl-a含量無明顯回升,表明川蔓藻對銅綠微囊藻持續化感作用抑制了Chl-a的合成.

C組:處理組Chl-a含量在0~6d小幅度降低,在6~12d小幅度增加,對照組與處理組之間抑制作用差異顯著(<0.05),后期的微小回升可能是由于部分普通小球藻出現抗性,從而有了少量的繁殖.

對比3組結果可知,川蔓藻對2種浮游藻類Chl-a的合成均產生了抑制,而銅綠微囊藻光合系統抵御川蔓藻化感抑制的能力小于普通小球藻.葉綠體在光照條件下可以在PSI的還原側產生活性氧(ROS),ROS對胞內組分有較強的反應能力,可直接破壞Chl-a[30].川蔓藻可能導致浮游藻類細胞內ROS增加,從而降低Chl-a含量.

2.3 川蔓藻對浮游藻類Fv/Fm和ETR的抑制效果

v/m值比Chl-a在反應光合能力的變化上具有更高的靈敏度[31],從快速光曲線計算v/m和ETR的變化,如圖3(a)所示,各處理組的v/m均低于對照組,說明川蔓藻顯著影響了普通小球藻和銅綠微囊藻的PSⅡ的光合轉化效率(<0.05).

值得注意的是,圖3(b)中,所有處理組在0~2d的ETR在實驗期間均高于對照組,峰值分別為52.83, 29.3,52.67μmol/(m2·s).第2d后,處理組中銅綠微囊藻ETR值持續保持降低,且低于對照組.而普通小球藻與混合藻ETR值達到峰值后再降低到一個近恒定值,且始終高于對照組.

浮游藻類細胞光合色素含量降低會減少光抑制效應,使光系統Ⅱ電子傳遞效率增加,提高光合系統的陽光-生物質能量轉換效率[32-33].說明當浮游藻類的PSⅡ系統受到川蔓藻化感物質脅迫時,Chl-a含量降低,但可通過提高光生電子轉移速率來維持光合系統的正常運轉.最終普通小球藻的光合系統電子轉移速率已達到新的平衡,然而銅綠微囊藻組ETR值在4~14d遠小于對照組和普通小球藻組,說明銅綠微囊藻的這種抗脅迫作用較普通小球藻弱.

2.4 川蔓藻對浮游藻類SC和MDA的抑制效果

圖4中,各處理組的SC含量均低于對照組,說明在川蔓藻所產生的化感物質的脅迫作用下,普通小球藻與銅綠微囊藻的SC合成受到了阻礙,抑制效果顯著(<0.05).也從另一方面證實了浮游藻類葉綠素合成受阻,光合作用受到抑制,SC得不到及時的補充.

圖4 川蔓藻共培養條件下浮游藻類SC含量的變化

圖5 川蔓藻共培養條件下浮游藻類MDA含量的變化

圖5中,A組:處理組MDA含量隨培養時間顯著增加(<0.05),5d后,趨于穩定,MDA最大值為0.1766μmol/mL,超出對照組的2倍;B組:處理組在第4d達到最大值,然后在4~6d急劇減少并保持恒定,表明細胞膜受損促進了銅綠微囊藻的死亡;C組:處理組在0~8d內MDA濃度不斷上升,并且高于對照組,說明藻細胞膜破裂程度不斷加重,第8d之后,隨著普通小球藻數量的穩定,而銅綠微囊藻大量死亡,MDA值也逐漸降低.

王衛紅等[34]研究表明,川蔓藻浸提液會使普通小球藻內膜破裂,胞內蛋白核和淀粉核釋放,進而使普通小球藻表面疏水性降低,導致藻細胞絮凝沉降死亡.藻類細胞膜是由不飽和磷脂組成的,這些磷脂容易受到ROS的影響[35].據此推測,處理組MDA的增加可能是因為川蔓藻釋放的化感物質誘導浮游藻類產生過量ROS,使普通小球藻和銅綠微囊藻中膜脂過氧化,同時對細胞膜的不飽和酸造成傷害.

2.5 川蔓藻對浮游藻類SOD的抑制效果

環境脅迫可增加藻類ROS的產生,導致嚴重的細胞損傷或死亡.因此,維持適當的ROS水平非常重要[36].SOD作為氧化和抗氧化防御系統中重要的組成成分,其含量變化反映了藻類細胞所受到的環境壓力的脅迫程度[37].

圖6 川蔓藻共培養條件下浮游藻類SOD活性的變化

圖6中,A組:對照組在0~4dSOD逐漸增加,在適應期內新環境會對普通小球藻造成一定的脅迫,而使活性氧自由基增加,進而促進SOD的產生.在第4d之后普通小球藻適應了新環境,不再需要過多的SOD,SOD含量逐漸減少并趨于穩定.與對照組相比,處理組產生了更多的SOD,兩組的差值在第6d時達到頂峰,且處理組SOD含量始終高于對照組,說明川蔓藻的存在對普通小球藻造成了脅迫,并且這種脅迫一直存在.

B組:對照組在0~4d由于對新環境的不適應和浮游藻類的增殖使浮游藻類體內的SOD含量迅速增加,在4~6d增速減緩,銅綠微囊藻進入快速生長期,由圖1(a)和圖2可知,第6d之后盡管銅綠微囊藻仍處于快速生長期,但SOD的含量在逐漸減少,說明銅綠微囊藻已經不再受到環境的脅迫.

處理組中的SOD含量在第2d時多于對照組,說明銅綠微囊藻不僅受到了新環境的影響,還受到了川蔓藻所產生的化感物質所帶來的脅迫.與圖1(a)對比可知,銅綠微囊藻在2~6d數量迅速降至最低,只有不到6%的藻存活,而在此期間SOD濃度減少的趨勢相對較平緩,說明SOD與銅綠微囊藻數量的比值很大,即每個銅綠微囊藻所產生的SOD仍很多,隨著銅綠微囊藻的數量不斷減少,SOD的產生也最終趨于平穩.

C組:總體上混合藻的SOD值變化與銅綠微囊藻組類似,但由于普通小球藻的存在,使得SOD變化趨勢減緩,含量介于A、B組之間.實驗前期處理組SOD含量均高于對照組,說明川蔓藻的存在確實對浮游藻類造成了脅迫,氧化抗氧化系統失去平衡.實驗后期,銅綠微囊藻氧化抗氧化系統對新環境適應能力低于普通小球藻,使得對照組SOD含量無法減少,而處理組因為銅綠微囊藻數量減少以致SOD含量同樣表現出降低趨勢.

總體來看,在4~14d內,3種浮游藻類的處理組SC,MDA和SOD變化趨勢均類似,而ETR值表現為普通小球藻處理組顯著高于對照組,銅綠微囊藻處理組則低于對照組.可以推測,普通小球藻對川蔓藻化感物質的抗性來源于通過提高光生電子轉移速率來維持光合系統的正常運轉.

3 結論

3.1 川蔓藻對普通小球藻、銅綠微囊藻以及混合藻抑制率最大值分別為80.95%、94.18%和94.01%.川蔓藻對銅綠微囊藻的抑制作用強于普通小球藻.

3.2 共培養過程中,兩種藻活性氧自由基濃度增加,破壞葉綠素,影響光合系統對光能的吸收轉化,可溶性糖得不到補充.藻類氧化抗氧化系統失去平衡,生理代謝受到影響,細胞膜過氧化異常,造成細胞無法繁殖甚至死亡.

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Allelopathic effect ofonand

ZHANG Xin1,2,3, LU Xue-qiang1,2,3*, WANG Lan1,2, HAN Xiao-xin1,2, MAO Hai-yan4

(1.College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300350, China；2.Tianjin Key Laboratory of Environmental Technology for Complex Trans-Media Pollution, Nankai University, Tianjin 300350, China；3.Tianjin International Joint Research Center for Environmental Biogeochemical Technology, Nankai University, Tianjin 300350, China；4.Xiamen Ocean Rock Ecology & Environment Co., Ltd, Xiamen 361023, China)., 2019,39(4)：1589~1595

One submerged macrophyte () and two algae (and) were selected to test the allelopathic effect of submerged macrophyte on algae. The parameters including optical density, chlorophyll a, maximum photochemical quantum yield, relative electron transport rate, soluble sugar, malondialdehyde, and superoxide dismutase activity were measured for three co-culture treatments of+,+, and+ mixture ofand(:=1:1). The growth of,and mixed algae were rapidly and greatly inhibited with the presence of. The inhibition rates in the three treatments reached the maximums on the 6th day, which were 80.95%, 94.18% and 94.01%, respectively. The values of optical density, chlorophyll a, soluble sugar and maximum photochemical quantum yield for the three treatments were lower than those for the corresponding controls, and showed a significantly downward trend with time, indicating that the photosynthetic capacity of the treatments became weakening gradually. However, the values of malondialdehyde and superoxide dismutase of the treatments were higher than those of the corresponding controls for the first six days, indicating the possible occurrence of the membrane peroxidation of the algae.

；；；allelopathic effect

X524

A

1000-6923(2019)04-1589-07

2018-09-21

水體污染控制與治理科技重大專項(2018ZX07110-007);天津市科技計劃項目(18PTZWHZ00110)

*責任作者, 教授, Luxq@nankai.edu.cn

張 欣(1995-),女,山西長治人,南開大學碩士研究生,主要從事水生態修復原理與技術研究.