亞砷酸鈉對SH-SY5Y細胞周期的影響及MPST過表達的干預

柳香香,孫達權,許鍵煒，范海瓊,徐國強,潘際剛

(1.貴州醫科大學基礎醫學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州醫科大學干細胞與組織工程實驗中心，貴州 貴陽 550004；3. 黔東南民族職業技術學院醫藥技術系，貴州 凱里 556000)

砷及其化合物具有毒性，在我國一些地區嚴重超標，經人體攝入后，易引起急、慢性砷中毒，造成肝臟、心臟、腎臟或皮膚等器官或組織損傷[1]。研究顯示，神經細胞難以再生，且對毒性物質更加敏感，因而砷暴露時間過長將損傷神經系統[2-3]。因此，如何有效預防和治療砷中毒顯得尤為重要。3-巰基丙酮酸硫轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，MPST或3-MST)由297個氨基酸組成，定位于細胞質。MPST以單體或二硫鍵連接的同型二聚體存在，其功能是催化硫離子的轉移，使硫離子結合硫醇化合物(如氰化物)，進而參與氰化物解毒和半胱氨酸降解[4]。本課題組前期研究顯示，亞砷酸鈉(sodium arsenite，NaAsO2)可抑制PC-12和SH-SY5Y神經細胞生長，下調MPST蛋白表達[5-6]。因此，本研究采用SH-SY5Y細胞為研究對象，外源性過表達MPST蛋白，觀察其在NaAsO2干預神經細胞生長周期中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，購自德國DSMZ公司。

1.1.2試劑 胎牛血清(FBS)，購自杭州四季青公司；青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶，購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)和結晶紫染液，購自北京索萊寶公司；DMEM培養基，購自美國HyClone公司；NaAsO2，購自美國Sigma公司；CCK-8溶液，購自日本同仁；PI單染細胞周期檢測試劑盒，購自南京凱基；抑癌基因p53蛋白抗體、細胞周期調控因子CDC25A抗體、細胞周期蛋白A(cell cycle protein A，CyclinA)抗體、周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)抗體、MPST抗體、抗小鼠IgG-HRP二抗，購自美國Santa Cruz公司。

1.1.3儀器 Model 310細胞恒溫CO2培養箱(美國Thermo公司)；細胞培養超凈臺(蘇州凈化)；全波段多功能酶標儀(BioTek公司)；Eclipse Ti-s倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；全自動凝膠成像儀(美國SynGene)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 SH-SY5Y細胞培養在高糖DMEM培養基(含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素)中，培養于37 ℃、5% CO2的培養箱中，隔天換液，細胞生長至70%匯合度時進行傳代或凍存。

1.2.2慢病毒轉染MPST過表達 經PCR擴增、雙酶切、連接目的片段與載體、挑選陽性克隆、測序驗證，擴增培養陽性菌落，而后鑒定和抽提質粒。慢病毒包裝MPST質粒和空載體，收集病毒并測定滴度。SH-SY5Y細胞在12孔板生長至50%匯合度時進行轉染，細胞更換為含10 mg·L-1基因轉染增強劑聚凝胺(polybrene)及10% FBS的DMEM培養基，分別于不同孔加入1 mL含MPST和空載體的病毒液，分別設為過表達組和空載對照組，培養箱中繼續培養6 h后，更換含10% FBS的DMEM培養基繼續培養，細胞生長至90%匯合度時，以嘌呤霉素進行篩選，最終以蛋白印跡實驗驗證MPST表達水平。

1.2.3組別設置 實驗組別分別為：慢病毒轉染的過表達組(overexpression group)，簡稱OP組；空載對照組(no-load control group)，簡稱NC組；同時以正常模型細胞設立空白組(blank control group)，簡稱BC組。

1.2.4CCK-8法檢測 取對數期模型細胞，以每孔8×103個鋪于96孔板中，培養過夜，設6個NaAsO2濃度梯度(5、10、20、50、75、100 μmol·L-1)，每組5個復孔，同時設置調零孔和對照孔。放入培養箱繼續培養，分別于24、48 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，繼續培養3 h，酶標儀測定OD值(450 nm)，計算細胞活力。細胞活力=[(NaAsO2處理孔OD值-調零孔OD值)/(對照孔OD值-調零孔OD值)]×100%。

取對數期BC、NC和OP組細胞，分別以每孔8×103個鋪于96孔板中，培養過夜，每組設5個復孔，以含50 μmol·L-1NaAsO2的DMEM培養基處理上述3組細胞，同時設置調零孔及以BC細胞設置空白對照組，48 h后按上述方法繼續操作。

1.2.5結晶紫染色 選擇對數期BC、NC和OP組細胞接種于6孔板，培養箱培養至匯合度達到60%～70%時，細胞同步化12 h，然后以含50 μmol·L-1NaAsO2的DMEM培養基處理上述3組細胞，繼續無血清培養。24 h后結晶紫染色，細胞PBS洗3遍，每孔2 mL 4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗掉固定液后，雙蒸水洗2遍，每遍1 min，加入2 mL結晶紫染色10 min，雙蒸水洗滌后拍照，每組取拍照圖3～5張，人工計數后進行圖片和統計學處理。設BC組細胞貼壁存活率為100%，細胞貼壁存活率=(NaAsO2處理組細胞數/BC組細胞數)×100%。

1.2.6細胞周期檢測 取對數期BC、NC和OP組細胞鋪于6孔板中(5×109·L-1)，培養過夜，以含50 μmol·L-1NaAsO2的DMEM培養基處理上述3組細胞，同時以無NaAsO2的DMEM培養BC細胞作為空白對照，48 h后以不含EDTA的胰酶消化細胞，1 528×g離心5 min，PBS洗2次，70%乙醇于4 ℃ 冰箱固定30 min，1 528×g離心5 min，PBS洗2次，1 528×g離心5 min，棄PBS，加入300 μL PI/RNase染色工作液，室溫避光60 min，加入樣品管中，用流式細胞儀在488 nm激發光處檢測。

1.2.7蛋白印跡檢測 藥物處理細胞后，以RIPA細胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF)裂解細胞，冰上裂解10 min，20 627×g離心15 min，取上清液進行BCA蛋白定量，計算并配制上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，進行12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，用p53、CDC25A、CyclinA、CDK2抗體(1 ∶1 000)或內參抗體GAPDH(1 ∶2 000)于4 ℃搖床孵育過夜，PBS洗膜3次，抗小鼠IgG-HRP二抗室溫孵育1 h，PBS洗膜3次，PVDF膜以化學發光試劑盒顯色，凝膠成像儀成像，以Quantity One對蛋白印跡條帶處理和分析。

2 結果

2.1 NaAsO2和MPST對細胞活力的影響如Fig 1B所示，NaAsO2(5、10、20、50、75、100 μmol·L-1)分別處理模型細胞24、48 h，48 h時NaAsO2對模型細胞的IC50為50 μmol·L-1。蛋白印跡實驗發現(Fig 1A)，BC和NC組MPST蛋白表達無明顯差異；而與NC組相比，OP組MPST蛋白表達明顯升高(P<0.01)。以NaAsO2(50 μmol·L-1)處理3組細胞48 h，結果顯示(Fig 1C)，BC和NC組細胞存活率明顯降低(P<0.01)；BC和NC組間細胞存活率無明顯差異；而與NC組相比，OP組細胞存活率明顯升高(P<0.01)。

2.2 NaAsO2和MPST對細胞貼壁能力的影響如Fig 2所示，NaAsO2(50 μmol·L-1)處理48 h，BC和NC組細胞貼壁力明顯降低(P<0.01)，BC和NC組細胞貼壁存活率無明顯差異；與NC組相比，OP組細胞貼壁存活率明顯回升(P<0.01)。

2.3 NaAsO2和MPST對細胞周期的影響如Fig 3、Tab 1所示，NC加藥組和BC加藥組細胞周期無明顯差異，與空白組相比，給予NaAsO2(50 μmol·L-1)處理48h后，BC和NC組細胞S期比例明顯增加(P<0.01)；而與NC組相比，OP組細胞S期比例明顯減少(P<0.05)。

Fig 1 Effects of NaAsO2 and MPST over-expressionon cell viability of SH-SY5Y

A：MPST protein expression level；B：Effects of different concentrations of NaAsO2on the viability of model cells；C：Effect of NaAsO2on the viability of cells in each group.**P<0.01vsNC；##P<0.01vsBC alone.

2.4 NaAsO2和MPST對蛋白表達的影響如Fig 4所示，NaAsO2(50 μmol·L-1)處理48 h， BC和NC組細胞p53蛋白明顯上調，CDC25A、CyclinA及CDK2蛋白明顯下調(P<0.01)；BC和NC組細胞各蛋白表達無明顯差異；與NC組相比，OP組細胞上述改變明顯被拮抗(P<0.05,P<0.01)。

Fig 2 Effect of MPST over-expression on cell adherenceviability of NaAsO2 inhibition

A：Effect of NaAsO2on the viability of adherent cells in each group；B：Adherence survival rate.**P<0.01vsNC；##P<0.01vsBC alone.

Tab 1 Effects of NaAsO2 and MPST over-expression on cell cycle in all group

##P<0.01vsBC;*P<0.05vsNC+NaAsO2

3 討論

環境中的砷一般以無機砷化物的形式存在，如NaAsO2、三氧化二砷、砷酸鹽等，長期暴露于無機砷化物環境中可引起神經系統損傷、心血管疾病、泌尿系統等疾病[7]。砷進入血液后可通過血腦屏障進入大腦，進而損傷神經系統。研究表明[8]，NaAsO2可誘導神經細胞凋亡，抑制細胞骨架形成，破壞細胞正常結構。

前期工作表明[5]，NaAsO2可抑制SH-SY5Y細胞生長。而本研究發現，MPST過表達能明顯抑制NaAsO2導致的細胞活力和貼壁能力下降的效應。

Fig3Cellcyclechangesineachgroup

A：BC group；B：OP group；C：Treatment of BC group with NaAsO2；D：Treatment of NC group with NaAsO2；E：Treatment of OP group with NaAsO2.

Fig 4 Changes of p53,CDC25A,CyclinA and CDK2 protein expression in different

*P<0.05，**P<0.01vsNC；##P<0.01vsBC alone

有報道，NaAsO2或三氧化二砷能誘導人正常肝細胞G2/M期阻滯、生長抑制[9]。本研究也發現，NaAsO2明顯誘導SH-SY5Y細胞S期阻滯，而過表達MPST可減輕NaAsO2對S期的阻滯效應。這些結果提示，MPST過表達所發揮的保護效應可能與降低細胞S期阻滯有關。

為了探討MPST對細胞S期相關蛋白的影響，我們進一步觀察了p53、CDC25A、CyclinA及CDK2等S期相關蛋白的表達情況。研究發現，經NaAsO2處理后，SH-SY5Y細胞CyclinA、CDK2及CDC25A明顯下調，p53明顯上調；而過表達MPST可拮抗NaAsO2對CyclinA、CDK2、CDC25A及p53的作用。

CyclinA-CDK2是細胞S期主要的復合物，能啟動DNA的復制[10-11]。據報道，阿霉素誘導肝癌細胞HepG2 S期阻滯，伴隨CyclinA、CDK2及CDC25A表達下調[12]。有研究報道，miR-155可通過上調p53蛋白表達，誘導前列腺癌細胞周期阻滯[13]。在本研究中，NaAsO2可能通過上調p53，下調CyclinA、CDK2、CDC25A蛋白表達，誘導SH-SY5Y細胞S期阻滯；過表達MPST通過調節S期相關蛋白表達，發揮對NaAsO2毒性損傷的拮抗效應。

硫化氫對化學性神經細胞損傷具有保護作用，而MPST是硫化氫的內源性合成酶[4，14]。因此，外源性過表達MPST增加了內源性硫化氫，進一步拮抗砷造成的細胞S期阻滯，從而發揮對神經細胞的保護效應。本實驗將為臨床神經性砷中毒的防治提供一定的實驗依據。

(致謝：本實驗在貴州醫科大學生理學教研室實驗室完成，感謝所有老師和同學對本課題研究給予悉心指導和幫助。)