p53抑制鐵死亡抵抗HT22細胞谷氨酸神經毒性

宣文婷，楊澤勇，季雅茹，金衛林，李 俊，李元海

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院麻醉科，安徽 合肥 230022；2.上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院麻醉科，上海 200030；3.上海交通大學電子信息與電氣工程學院，上海 200240；4.安徽醫科大學藥學院，安徽 合肥 230032)

鐵死亡(ferroptosis)是在2012年Cell雜志上最先被提出，有別于傳統死亡方式的一種新型的死亡形式的概念，它是一種以鐵和活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)依賴為特征的細胞調節性壞死。在細胞的形態、生化指標、基因水平方面，與其他的調節性壞死有明顯的區別[1]。近年來研究發現，鐵死亡發生可能在許多神經退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森綜合征、腦缺血性中風的發生、發展中起重要作用[2]。

氧化應激和眾多神經退行性疾病有著重要的聯系，谷氨酸鹽(glutamate, Glu)引起的氧化應激是神經退行性疾病的一種重要的誘因。Glu損傷模型是研究氧化應激引起的神經細胞死亡的一種常用模型。使用高濃度的Glu孵育神經細胞來抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉運系統xCT(cystine/glutamate antiporter或system Xc-, xCT或SLC7A11)，從而抑制胱氨酸的攝入，引起細胞內谷胱甘肽(glutathione,GSH)剝奪和ROS積聚[3]。雖然Glu引起神經細胞死亡主要是由GSH剝奪引起的細胞內ROS積聚引起，但并不是唯一機制。有研究表明，caspase依賴的凋亡途徑參與12-脂氧合酶(12-lipoxygenase，12-LOX)的激活，凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)的轉位與Glu引起的神經毒性有關[4-5]。近年來，在海馬切片培養組織進行抑制鐵死亡的實驗中，發現抑制鐵死亡可以抑制Glu引起的神經細胞死亡[1]。

p53屬于p53家族，主要作用是調控細胞周期，誘導細胞凋亡和DNA損傷，是一種在多種癌癥中均發生明顯改變的重要抑癌基因。除了腫瘤抑制作用外，p53還在神經退行性疾病、機體的衰老中發揮重要作用[6]。有研究顯示，p53可以通過調節xCT的表達，增加腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性，從而發揮抑癌作用[7]，但在神經系統中，其對鐵死亡的影響尚不清楚。因此，本研究使用p53特異性激活劑Tenovin-1,在HT22細胞中誘導高p53狀態，使用Glu損傷模型模擬神經退行性疾病中氧化應激損傷，探討鐵死亡是否參與p53抵抗HT22細胞Glu損傷及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與試劑 小鼠海馬神經元細胞系HT22細胞，上海交通大學金衛林老師實驗室饋贈。胎牛血清，購自南美Lonsera公司；DMEM/F-12細胞培養液，購自美國HyClone公司；0.25%胰酶消化液，購自Gibco公司；谷氨酸粉(批號09581)、Hoechst 33342活細胞染料劑(批號B2261)，購自美國Sigma公司；p53特異性激活劑Tenovin-1(批號：S8000)、鐵死亡特異性誘導劑Erastin(批號：S7242)，購自美國Selleck公司；p53抗體(批號：10442-1-AP)，購自武漢三鷹；4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)(批號：ab46545)、xCT(批號：ab175186)抗體，購自英國Abcam公司；β-actin、GAPDH抗體，購自美國Santa Cruz公司；FITC標記山羊抗兔抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DHE熒光探針、細胞增殖檢驗試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)，購自碧云天生物技術研究所；ECL發光試劑盒、BODIPYTM581/591 C11脂質氧化探針，購自美國Thermo Fisher公司；FeRhoNoxTM-1鐵離子探針，購自日本Goryochemical公司。

1.1.2儀器 熒光顯微鏡(德國Leica公司);細胞培養箱(美國Thermo公司)；酶標儀(德國Tecan公司)；離心機(德國Beckman公司)；蛋白電泳儀、Bioshine ChemiQ化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞分組 HT22細胞隨機分為6組：① 對照組(CON組)：HT22細胞置于DMEM/F12完全培養基中常規培養；② p53高表達組(p53-H組)：使用終濃度1 μmol·L-1Tenovin-1預處理HT22細胞6 h，使HT22細胞處于高p53狀態；③ 谷氨酸處理組(Glu組)：使用終濃度5 mmol·L-1的Glu處理HT22細胞；④ Erastin處理組(Era組)：使用終濃度0.5 μmol·L-1的Erastin處理HT22細胞；⑤ p53高表達后谷氨酸處理組(Glu-p53組)：使用終濃度1 μmol·L-1的Tenovin-1預處理HT22細胞6 h后，使用終濃度5 mmol·L-1Glu處理；⑥ p53高表達后Erastin處理組(Era-p53組)：使用終濃度1 μmol·L-1的Tenovin-1預處理HT22細胞6 h后，使用終濃度0.5 μmol·L-1的Erastin處理HT22細胞。

1.2.2HT22細胞活力的檢測 采用CCK-8法檢測。取對數生長期的HT22細胞，以1×104個/孔接種于96孔板，培養12 h后，加入不同濃度Glu(終濃度為1、5、10 mmol·L-1)和Erastin(0.25、0.5、1 μmol·L-1)，另設對照組(CON)和空白孔(相應量細胞培養液和CCK-8溶液)，每孔設5個復孔。置于孵育箱培養6 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液(每孔培養基100 μL)，置于孵育箱孵育2 h后，在酶標儀450 nm波長處測定各孔吸光度值(A),計算各實驗孔相對存活率。相對存活率=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)，實驗重復3次。

1.2.3PI/Hoechst熒光雙標染色法檢測HT22細胞高p53狀態對Glu損傷和Erastin誘導的鐵死亡的保護作用 以5×104個/孔接種于24孔板的HT22細胞，按照“1.2.1”方法分組處理。處理8 h后，將終濃度為5 mg·L-1Hoechst 33342和 PI溶液加入完全培養基，避光，37 ℃、5% CO2孵育10 min，置于熒光顯微鏡下觀察拍照，計算相對細胞存活率。相對細胞存活率以大于500個細胞數的Hoechst+與(Hoechst++PI+)的比值來表示。實驗重復3次。

1.2.4Western blot檢測p53和xCT蛋白表達差異 ① p53蛋白表達水平的檢測：HT22細胞以1×105個/孔接種于6孔板，培養12 h后，加入不同濃度的Tenovin-1(0.1、1、10 μmol·L-1)處理6 h后，制取樣品，經PBS沖洗2遍，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解10 min，使用細胞刷刮下細胞，置于1.5 mL EP管中，超聲3次，每次5 s。用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣品與3×SDS上樣緩沖液按2 ∶1體積混合，100 ℃煮沸5 min變性，迅速置于冰上使溫度降至室溫后，13 000×g離心5 min。以每孔35 μg蛋白樣品量進行蛋白電泳后，使用200 mA恒流 1 h，將蛋白轉至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。TBST洗滌3遍，每次5 min。p53、β-actin抗體按1 ∶1 000稀釋，室溫放置1 h，4 ℃過夜后，TBS洗滌3遍，每次10 min。加入1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，使用ECL發光試劑盒顯影，以β-actin作為內參。② xCT蛋白表達水平檢測：HT22細胞以1×105個/孔接種于6孔板，培養12 h后，按“1.2.1”方法進行分組處理，處理8 h后，按如上方法制備樣品，使用Western blot檢測xCT蛋白表達水平。xCT、GAPDH抗體按1 ∶1 000稀釋。

1.2.5免疫熒光檢測脂質氧化產物4-HNE生成 以5×104個/孔接種于24孔板細胞爬片的HT22細胞，按照“1.2.1”方法，選取Glu處理組(①、②、③、⑤組)進行處理，處理8 h后，用PBS洗滌2遍，使用4%的多聚甲醛置于室溫固定15 min，將細胞用PBS沖洗3遍，使用15%的驢血清室溫封閉1 h，細胞使用PBS清洗3遍后，加入一抗(4-HNE，稀釋比例為1 ∶200)，室溫孵育1 h后4 ℃過夜。d 2，PBS洗滌3遍，加入二抗(稀釋比例為1∶400)，室溫孵育1 h，PBS洗滌3遍，使用含有10 mg·L-1DAPI-甘油封片劑封片后，熒光顯微鏡下觀察，比較不同組的平均熒光強度。

1.2.6BODIPY 581/591 C11脂質氧化熒光探針檢測細胞內脂質氧化 以5×104個/孔接種于24孔板的HT22細胞，按照“1.2.1”方法選取Glu損傷組(①、②、③、⑤組)處理8 h。甲醇溶解BODIPY 581/591 C11熒光探針至濃度為10 mmol·L-1的貯存液，將終濃度為1 μmol·L-1BODIPY 581/591 C11熒光探針加入處理完成的細胞，置于37 ℃孵育箱孵育30 min后，使用PBS沖洗2遍，清除未結合的染料，熒光顯微鏡觀察熒光效果，比較不同組的平均熒光強度。

1.2.7FeRhoNoxTM-1熒光探針檢測細胞內Fe2+變化 以5×104個/孔接種于24孔板的HT22細胞，按照“1.2.1”方法選取Glu損傷組(①、②、③、⑤組)處理8 h。使用DMSO將FeRhoNoxTM-1熒光探針溶解為1 mmol·L-1的儲存液。于24孔板處理完成的細胞，使用PBS沖洗2遍后，用HBSS溶液稀釋FeRhoNoxTM-1儲存液至5 μmol·L-1工作液，每孔加入200 μL工作液，于37 ℃、5% CO2孵育箱孵育1 h后，用HBSS溶液沖洗2遍，置于熒光顯微鏡下觀察，計算各組平均熒光強度。

2 結果

2.1 Tenovin-1引起HT22細胞p53蛋白水平上升Tenovin-1(0.1、1、10 μmol·L-1)濃度依賴性引起HT22細胞p53蛋白水平上升，按照產品介紹，Tenovin-1作用后6 h即可引起HT22細胞內p53水平上升，故選擇Tenovin-1預處理6 h。如Fig 1所示，相較于對照組，當1 μmol·L-1Tenovin-1作用于HT22細胞6 h后，p53蛋白水平明顯上升(P<0.05)。因此，選取1 μmo·L-1Tenovin-1作為后續實驗誘導p53高表達的最適濃度。

2.2 p53抵抗Glu、Erastin引起的HT22細胞神經毒性Glu(1、5、10 mmol·L-1)濃度依賴性地抑制HT22細胞的活力，當Glu濃度為5 mmol·L-1時，HT22細胞存活率約為40%(P<0.01)，故選擇5 mmol·L-1作為后續實驗的合適損傷濃度。如Fig 2A所示，使用1 μmol·L-1Tenovin-1預處理6 h引起HT22細胞p53高表達后，可明顯抑制Glu引起的細胞死亡(P<0.01)。為了確定p53是否可以抵抗鐵死亡，另外使用了經典的鐵死亡誘導劑Erastin誘導HT22細胞發生鐵死亡，檢測p53對此模型的作用。如Fig 2B所示，Erastin(0.25、0.5、1 μmol·L-1)明顯抑制HT22細胞活力，當Erastin濃度為0.5 μmol·L-1時，HT22細胞存活率約為35%(P<0.01)，故選擇0.5 μmol·L-1作為后續實驗的合適損傷濃度。使用1 μmol·L-1Tenovin-1預處理6 h引起HT22細胞p53高表達后，結果顯示，HT22細胞高p53狀態可明顯抑制Erastin引起的細胞死亡(P<0.01)。

Fig 1 Increased p53 protein levels inducedby Tenovin-1 in HT22

*P<0.05vscontrol

2.3 p53降低Glu引起的HT22細胞內ROS水平升高如Fig 3所示，Glu處理8 h后，HT22細胞內ROS水平相較于對照組明顯增加(P<0.01)；與Glu組相比，Glu-p53組ROS水平明顯下降(P<0.01)。

2.4 p53抑制Glu引起的HT22細胞內脂質氧化水平的升高如Fig 4A所示，Glu處理8 h后，HT22細胞內脂質氧化的水平相較于對照組上升了約4倍，而與Glu組相比，Glu-p53組脂質氧化的水平明顯下降(P<0.01)。4-HNE是細胞脂質代謝的產物，當細胞發生脂質氧化后，其細胞內含量會明顯上升。如Fig 4B所示，當Glu處理8 h后，4-HNE細胞內含量相較于對照組明顯上升(P<0.01)，而在Glu-p53組4-HNE水平明顯下降(P<0.01)。

2.5 p53抑制Glu誘導的HT22細胞內Fe2+水平升高如Fig 5所示，與對照組相比，Glu組HT22細胞內Fe2+濃度上升約4倍(P<0.01)，而與Glu組相比，Glu-p53組HT22胞內Fe2+濃度明顯下降(P<0.01)。表明p53高表達明顯抑制了Glu所引起的Fe2+濃度的增加。

2.6 p53逆轉Glu和Erastin引起的HT22細胞xCT表達的抑制如Fig 6A所示，與對照組相比，Glu組xCT蛋白表達水平下降(P<0.05)；而與Glu組相比，Glu-p53組xCT蛋白表達明顯上升(P<0.05)。在經典鐵死亡誘導劑Erastin損傷模型中(Fig 6B)，與對照組相比，Era組xCT蛋白表達水平明顯抑制(P<0.01)；與Era組相比，Era-p53組xCT蛋白表達水平明顯上升(P<0.05)。

Fig 2 HT22 cell viability inhibited by different concentrations of Glu and erastin,cell damage induced by Glu and erastin attenuated by p53 in HT22

A: Glutamate reduced the survival rate of HT22 cells and p53 attenuated the damage induced by glutamate in HT22 cells; B: Erastin decreased the survival rate of HT22 cells and p53 attenuated the damage induced by erastin in HT22 cells.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsGlu or erastin.

Fig 3 Glu-induced intracellular ROS reduced by p53 in HT22

3 討論

鐵死亡是以脂質氧化和鐵依賴性途徑為特征的細胞調節性壞死，它與傳統的caspase依賴性的凋亡和已確定通路的細胞壞死不同。近年來，有研究顯示，鐵死亡與帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥之間可能存在著密不可分的聯系[8-11]。

Fig 4 Glu-induced lipid oxidation decreasedby p53 in HT22

A:p53 reduced lipid ROS in HT22 cells induced by glutamate; B: p53 decreased expression of 4-HNE in HT22 cells induced by glutamate(scale bar=100 μm).**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsGlu.

有研究表明，在肺癌和骨肉瘤等細胞中，鐵死亡的發生與p53的激活密不可分,此過程主要依賴System Xc-的主要組成部分xCT的直接轉錄抑制，并且發現p53蛋白的乙?；?，對其調節鐵死亡和腫瘤的抑制作用發揮至關重要的影響[12]。故本研究使用了Glu損傷模型模擬神經退行性疾病中的氧化應激損傷，選取HT22細胞作為研究對象。結果發現，p53不僅沒有增加HT22細胞對Glu損傷的敏感性，反而使HT22細胞抵抗了Glu對其的神經毒性。而鐵死亡在其中發揮了什么作用，我們進行了進一步的研究。

我們又使用了鐵死亡經典誘導劑Erastin來誘導HT22細胞發生鐵死亡，首先使用Tenvion-1對HT22細胞預處理6 h誘導高p53狀態，然后使用Erastin誘導鐵死亡。結果發現，相較于Era組，Era-p53組細胞存活率明顯上升，說明p53可抵抗HT22細胞發生鐵死亡。為了驗證在Glu損傷模型中，是否也是因為p53抑制了鐵死亡，進而使HT22細胞能夠抵抗Glu神經毒性，我們進一步檢測了HT22細胞在高p53狀態和正常狀態下，Glu作用后的鐵死亡相關指標的改變情況。發現相較于Glu組，Glu-p53組細胞內ROS、脂質氧化和Fe2+的水平均明顯下降，提示p53確實是抑制了HT22細胞發生鐵死亡，從而使HT22細胞能夠抵抗Glu的神經毒性。

由于有研究表明，在肺癌和骨肉瘤細胞中，p53增加腫瘤細胞對鐵死亡的敏感性可能是因為調節了xCT蛋白的表達[7]。為了進一步探討p53抵抗鐵死亡可能的機制，我們檢測了HT22細胞中xCT蛋白表達情況，發現Glu組和Era組，xCT蛋白表達被抑制，這也驗證了之前的研究[13]。而在Glu-p53組和Era-p53組中，xCT蛋白表達的抑制被不同程度逆轉，但p53是否直接調控xCT蛋白表達，以及通過何種途徑進行調控尚不清楚。本實驗認為，xCT在p53抑制Glu和Erastin損傷中起著關鍵的作用，但沒有對xCT進行沉默，觀察p53保護作用的改變，故此有待進一步研究。本實驗對p53在神經退行性疾病中與鐵死亡作用的探討主要在HT22細胞上進行，HT22細胞為小鼠海馬神經元細胞系，來自于HT4細胞系，正常狀態下貼壁生長，因缺乏離子通道型谷氨酸受體，故適宜作為研究Glu氧化應激損傷模型，廣泛應用于很多神經退行性疾病的研究。但其不同于原代神經細胞和動物體內神經元，因而p53在原代神經細胞和動物體內的作用仍需進一步研究。

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsGlu

Fig 6 Glu and erastin induced inhibition of xCT protein expression increased by p53 in HT22

A: p53 increased the expression of xCT in HT22 cells reduced by glutamate; B: p53 increased the expression of xCT in HT22 cells reduced by erastin.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsGlu or Era.

綜上所述，本研究表明，p53可通過抑制鐵死亡，使HT22細胞抵抗Glu產生的神經毒性。此研究為p53在神經退行性疾病中的作用和機制提供了新的研究思路。

(致謝：本實驗在安徽醫科大學藥學院教育部抗炎免疫藥物重點實驗室完成，感謝各位老師和同學的幫助。)