2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑抗腫瘤活性研究

張 飛，劉振國，王海芳，武祥龍，劉 柳，藺旭彬，呂文君，劉 浩

(1. 西北工業大學生命學院空間生物實驗模擬技術重點實驗室，陜西 西安 710072；2. 陜西省人民醫院重癥醫學科，陜西 西安 710068；3. 陜西中醫藥大學陜西省中西醫結合心血管病防治重點實驗室，陜西 西安 712046)

癌癥的明顯特征是腫瘤細胞不受控制和不規則的增殖，并且細胞周期和細胞分裂過程嚴重紊亂。腫瘤在機體內不停地轉移和侵襲，正常組織被嚴重破壞，最終導致機體的死亡[1]。面對癌癥發病率逐年增加，加快抗腫瘤新藥的研究迫在眉睫[2]。因此，發現新的抗腫瘤藥物并研究其作用機制，具有十分重要的意義。

利魯唑，化學名為2-氨基-6-三氟甲氧基苯并噻唑(Fig 1，化合物1)，目前用于治療側索硬化癥。韓國和美國學者分別發現了利魯唑對人肝癌細胞和乳腺癌細胞增殖有抑制作用[3-4]。本課題組主要從事利魯唑衍生物的鎮痛研究[5-7]，并且已經合成了12種利魯唑衍生物[8]，經過SciFinder查新發現，其中2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑(Fig 1，化合物4)是新化合物。關于其藥理活性作用有待研究，本實驗通過細胞增殖、凋亡和遷移實驗，研究化合物4的抗腫瘤活性。

Fig 1 Structure of riluzole(1) and

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 小鼠成骨MC3T3-E1細胞系、小鼠骨髓瘤SP2/0細胞系，人宮頸癌HeLa細胞系、人肝癌HepG2細胞系、人乳腺癌MCF-7細胞系，源自于本學院細胞種子庫。

1.1.2藥物與試劑 2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑為本課題組合成，純度99.9%。培養基α-MEM、RPMI 1640、DMEM，購自HyClone公司；胎牛血清，購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒，購自南京恩晶生物科技有限公司；Hoechst 33258、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，購自碧云天生物技術有限公司；索拉非尼，購自濟南晟齊醫藥科技有限公司。

1.1.3儀器 Synergy HT多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；Nikon 80i正置熒光顯微鏡(尼康儀器上海有限公司)；Olympus CKX41倒置式生物顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)。

1.2 方法

1.2.1CCK-8法測定藥物對腫瘤細胞增殖的影響 取對數生長期的HepG2、HeLa、MCF-7、MC3T3-E1貼壁細胞，消化，計數；對于半貼壁細胞SP2/0直接吹打離心，棄上清液，加入培養液吹打計數。以每孔2.5×103個細胞接種于96孔板，培養24 h，加入含有不同濃度2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑的培養液，使其終濃度為1.23、3.7、11.11、33.33、100 μmol·L-1，空白溶劑為對照組。孵育48 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，再孵育2 h，測定450 nm時吸光度值，根據公式：增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%，計算細胞增殖抑制率及IC50值[9]。

1.2.2毒性選擇性指數的計算方法 采用毒性選擇性指數(selectivity index，SI)來衡量化合物的安全性。計算公式為：某化合物的SI值=化合物對正常細胞的IC50值/化合物對腫瘤細胞的IC50值。SI值表示某個化合物可以抑制腫瘤細胞，但不損害正常細胞，當SI值大于1時，表示該化合物對腫瘤細胞的毒性大于對正常細胞的毒性；當SI值大于3時，表明該化合物的選擇性比較好，SI值越大表明化合物的抗腫瘤活性越好，對正常細胞的細胞毒性越小[10]。

1.2.3Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡 將對數期MCF-7細胞以每孔5×105個接種于6孔板內的蓋玻片上，培養24 h，然后加入含有不同濃度藥物(終濃度為12.5、25、50 μmol·L-1)的培養液。培養24 h，棄培養液，固定10 min，用PBS洗滌3次，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，孵育5 min，再用PBS洗滌3次。將蓋玻片轉移至載玻片上，封片。激發波長350 nm，發射波長460 nm條件下，熒光拍照，觀察細胞形態[11]。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數期的MCF-7細胞接種于6孔板內，每孔5×105個。培養24 h，加入含有不同濃度藥物(終濃度為12.5、25、50 μmol·L-1)的培養液。藥物作用24 h后，棄培養液，用PBS洗滌，消化，按試劑盒說明書步驟操作，采用流式細胞儀檢測。

1.2.5劃痕實驗檢測藥物對MCF-7細胞遷移能力的影響 細胞劃痕實驗可以檢測貼壁腫瘤細胞的遷移能力，是一種常用的檢測細胞運動的方法。以每孔5×105個細胞將對數期細胞接種于6孔板內，培養24 h。用1 mL槍頭在孔內沿直徑方向畫粗細均勻的1條豎線，PBS洗掉劃下的細胞和碎片，在光學顯微鏡下拍照記錄給藥前的劃痕情況。加入含有藥物的培養液，終濃度為25 μmol·L-1，孵育24 h，再次拍照記錄劃痕狀態[12]。計算劃痕的相對愈合率，公式為：劃痕的相對愈合率=(0 h的劃痕寬度-24 h的劃痕寬度)/0 h的劃痕寬度×100%。

2 結果

2.1 化合物4對腫瘤細胞增殖的抑制作用CCK-8法檢測不同濃度的化合物4(1.23、3.7、11.11、33.33、100 μmol·L-1)對HeLa、HepG2、MCF-7、SP2/0細胞增殖的影響，取藥物濃度的對數作為橫坐標。由Fig 2可見，隨著濃度的增加，化合物4對4種腫瘤細胞增殖抑制率均明顯增加，尤其對MCF-7細胞作用最明顯，在濃度較低時就表現出很好的增殖抑制作用。

Fig 2 Proliferation inhibitory rate to HeLa,HepG2,

根據不同濃度下增殖抑制率，計算半數抑制濃度IC50值，索拉非尼作為陽性對照。由Tab 1可見，化合物4對4種細胞均有一定的抑制作用，其中對腫瘤細胞HepG2和MCF-7抑制作用接近陽性對照的作用效果。選取MC3T3-E1研究藥物對正常細胞的毒性，計算其IC50值，以此為標準，計算藥物對不同腫瘤的SI值?；衔?對4種腫瘤細胞的SI值均大于1，表明其對腫瘤細胞毒性大于對正常細胞的毒性。而對于HepG2和MCF-7的SI值都大于3，充分說明其對HepG2和MCF-7細胞具有較好的抗腫瘤活性，且對正常細胞毒性小。

2.2 化合物4對MCF-7細胞的促凋亡作用根據細胞毒性篩選實驗，發現化合物4對MCF-7細胞的抑制效果最明顯，故選用MCF-7作為研究對象，采用Hoechst 33258染色，觀察化合物4對MCF-7細胞核形態的影響。由Fig 3可見，空白對照細胞呈現完整的細胞核結構，具有圓形飽滿的細胞核，且顏色較暗。藥物濃度增加到25 μmol·L-1時，出現細胞核致密濃染的狀態，細胞核顏色呈現亮白狀態，這是細胞凋亡的典型特征。當濃度為50 μmol·L-1時，可以看到細胞核近似破裂，分散在胞質中，說明細胞已經凋亡。形態學結果表明化合物4能使細胞發生凋亡，從而抑制了細胞的增殖。

Tab 1 IC50 value and selectivity

Fig 3 Hoechst 33258 staining of MCF-7 cells treated by different drug concentrations for 24 h

Fig 4 Apoptosis of MCF-7 cells treated by different concentrations of compound 4 detected by flow cytometry

細胞凋亡的誘導是癌癥治療過程中的重要靶標，抗腫瘤藥物可以誘導和促進其凋亡[13]。采用Annexi V-FITC和PI雙染法研究化合物4對MCF-7細胞凋亡的影響，由Fig 4可見，空白組MCF-7細胞的存活率高達99.9%，說明在沒有藥物時，MCF-7細胞不受影響，正常生長。當藥物濃度為12.5 μmol·L-1時，早期凋亡細胞比例為13.84%；當濃度為25 μmol·L-1時，早期凋亡細胞的比例逐漸增加到25.54%；當給藥濃度增加到50 μmol·L-1時，早期凋亡細胞的比例增加到41.17%?？梢?，早期凋亡率隨著化合物4濃度增加而增大，并且早期凋亡率均大于壞死率，說明化合物4具有誘導MCF-7細胞早期凋亡的能力，并且具有濃度依賴關系。

2.3 抗遷移實驗研究如Fig 5所示，對照組細胞劃痕寬度愈合程度高，而給藥組的劃痕寬度變化不明顯?？瞻捉M的劃痕愈合率高達75%，給藥組劃痕愈合率只有16%，說明化合物4對MCF-7細胞具有一定的抗遷移能力。

Fig 5 Effect of compound 4 on migration

**P<0.01vscontrol

3 討論

利魯唑具有一定的抗腫瘤作用，本課題組設想其衍生物可能也具有抗腫瘤作用，因此，合成了2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑，并研究其抗腫瘤作用和機制。采用CCK-8法分析了該化合物對HeLa、HepG2、MCF-7、SP2/0細胞增殖的影響，發現其可以抑制這4種腫瘤細胞的增殖，作用效果沒有超過陽性對照索拉非尼。該化合物對MCF-7細胞的IC50值最接近陽性對照，作用效果最明顯，所以，采用MCF-7細胞深入研究了化合物抗腫瘤作用機制。

Hoechst染色是一種可以直接觀察細胞凋亡的方法，當細胞發生凋亡時，染色物質會固縮。在熒光顯微鏡下可以觀察到，凋亡細胞的細胞核呈現致密濃染狀態，或者呈現碎塊狀的致密濃染，顏色發白，而正常細胞核則呈現均勻的藍色。通過Hoechst 33258染色可見，化合物4濃度增加時，有明顯的細胞核濃染，說明化合物4可以使腫瘤細胞凋亡。

單層細胞劃痕實驗是經典且操作簡單的研究細胞遷移能力的體外實驗，顯微鏡下觀察不同時間點的劃痕寬度，可直觀看出細胞遷移情況。相對劃痕愈合率可以定量說明細胞遷移能力，遷移率越大，表明細胞遷移能力越強，反之，遷移能力越弱。本實驗結果提示，化合物4作用后的遷移率只有16%，而對照組的遷移率為75%，說明化合物4可以抑制細胞的遷移。

藥物使細胞凋亡的作用機制是復雜多樣的，本研究通過流式細胞分析法，獲得凋亡過程中細胞數量占比，分析細胞凋亡的原因。結果提示，隨著藥物濃度增加，早期凋亡細胞比率逐漸增加，表明化合物通過誘導細胞早期凋亡而發揮作用。在單層實驗中，濃度是一個關鍵因素，濃度太低時，無法觀察到抗遷移效果，濃度太高會使絕大多數細胞凋亡而無法形成細胞層。結合IC50值，經過多次預實驗，本研究選取了化合物4濃度25 μmol·L-1開展研究。

綜上所述，本實驗采用CCK-8法篩選了2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑對4種腫瘤細胞增殖的影響，發現其對4種腫瘤細胞具有明顯的增殖抑制活性和良好的選擇性，尤其是對MCF-7細胞作用效果最明顯。2-(N-丙基)-6-三氟甲氧基苯并噻唑還可以改變MCF-7細胞核形態，明顯抑制其遷移能力，誘導細胞的早期凋亡，本研究為開發新的抗腫瘤藥物提供了實驗基礎。

(致謝：本研究是在西北工業大學生命學院完成，衷心感謝各位老師和同學在實驗過程中的幫助與指導！)