基于高倍物鏡的相位顯微成像方法?

楊 穎 張 巖

(首都師范大學物理系,北京 100048)

0 引 言

顯微成像技術在光學測量領域中有著廣泛的應用.傳統的成像器件只對強度敏感,采集的圖像中只包含振幅信息,忽略了相位信息.對于相位型樣品,相位信息通常包含更多的細節特征.通過相位信息的測量,可以觀測到傳統方式無法檢測到的信息.在一些特定的應用領域,如顯微成像[1-2]、圖像加密解密[3-4]、精密元件檢測[5]、生物醫學研究[6]等具有重要的意義.

目前在顯微成像領域大多采用干涉方法.干涉方法主要通過記錄、解析物光與參考光的干涉信息,得到樣品的相位信息.激光技術及電耦合元件CCD(charge coupled device)的相繼發明,促進了數字全息等基于干涉方法的相位成像技術發展,很快應用于相位顯微成像領域[7].隨著技術及硬件的不斷發展,新興的干涉技術已經實現了細胞級別的相位顯微成像.2007年Choi 等[8]利用層析相位顯微術技術定量測定活體組織中三維折射率的分布情況,并展示了細胞結構隨時間的演變情況.2017年,Chowdhury 等[9]提出了一種基于結構照明的顯微成像方法,通過標準衍射層析計算,重建乳腺細胞三維折射率分布.這些基于干涉技術的相位成像方法,相位測量結果精度很高,然而對參考光有較強依賴,測量光路復雜光學器件成本高昂.迄今為止,如何實現既簡單又高效的相位顯微成像仍然是一個挑戰.

相位恢復方法作為一種非干涉相位測量技術,克服了干涉法的弊端,無需參考光束,光路簡單.相位恢復方法直接測量強度分布,經反復迭代計算得出相位信息.Gerchberg-Saxton(GS)算法開創了雙強度面迭代相位恢復方法的先河[10].楊顧算法是繼GS 算法后又一經典迭代類相位恢復算法,擴大了GS 算法的適用范圍[11].這兩種迭代類型的經典相位恢復算法,計算過程依賴于初始采集的兩個或單個強度面數據進行反復迭代.如果這兩個強度面給予的已知信息不夠充分,容易導致計算陷入局部極小停滯.并且這兩個面的測量數據伴隨整個迭代過程,如果初始采集存在實驗誤差,會制約重建結果的精度.因此繼GS 算法和楊顧算法之后,一些研究提出了多強度面重構完整波場的方法[12].這種方法增加了測量面的個數.每增加一個測量面的數據都增加了計算時的已知信息,可以迅速高精度地逼近重建目標,從而可以不經迭代[13]或僅迭代有限的次數[14],即可得到良好的重建結果.相位恢復方法廣泛用于相位測量、圖像處理和圖像加密.然而,相位恢復方法在顯微成像領域應用尚且不多.

本文將相位恢復方法與顯微成像相結合,通過光場強度測量,由相位恢復算法重構物體相位信息.顯微系統采用高倍大數值孔徑物鏡,提出了一種同步移動CCD 和顯微物鏡的拍攝方式,改變了傳統相位恢復方法單純移動CCD 位置的拍攝方法.解決了高數值孔徑物鏡的焦距值小,傳播面間采樣距離無法滿足成像關系的問題.本文所提出的顯微方法,重建過程無需迭代處理.與其它相位顯微方法相比,它具有非干涉、無迭代,實驗結構不復雜,成本低,操作方便等優點.可以應用于微米量級尺寸樣品的三維相位顯微成像研究.

1 高倍物鏡顯微成像原理

本文用普通光學高倍顯微物鏡構建顯微系統,實現相位顯微成像.用顯微系統拍攝樣品成像最清晰位置及兩個不同傳播距離的放大強度像,利用相位恢復算法重建物體的相位信息.采樣定理對傳播面的間隔距離有要求,如果間隔距離小于采樣要求,則可能無法恢復相位[15].

1.1 采樣定理及成像關系對傳播面間距的要求

基于高倍物鏡的顯微系統,實現相位顯微成像的關鍵是如何保證各物面位置滿足成像關系的同時,使它們之間距離滿足采樣公式的要求.顯微系統的成像關系與凸透鏡的成像規律一致.如果CCD能采集到放大實像,樣品所在平面(O0)及其衍射物面O1、O2應位于顯微系統2 倍焦距與焦距之間(圖1)[16].且3個采樣面間的距離應滿足采樣條件的要求.傳統的拍攝方法是移動CCD 位置采集O0、O1、O2的衍射放大像,以便進行相位重建.高倍物鏡數值孔徑較大焦距較短,物距(W0)大小與焦距(f)非常接近,二者差值應滿足采樣公式要求,以便能容納3個衍射物面.根據采樣關系,當入射波長(λ)一定時,相鄰衍射面間傳播距離(z)的取值,與衍射面像素數M、N以及采樣面上的采樣間隔Δx、Δξ相關,如圖2所示.z需至少滿足采樣公式的最低距離要求才能恢復相位[15].

圖1 顯微成像關系示意圖

圖2 采樣關系示意圖

如果λ=632.8 nm,相鄰衍射物面間像素大小Δξ=Δx=0.1 μm,像素數目(N)=512,那么z至少需大于29 μm.本文使用高倍物鏡(100 ×,數值孔徑(NA)=0.9)搭建顯微系統,f=2.149 8 mm,雖然理論上2 倍焦距與f之間的距離足夠容納多個衍射物面,但是由于高倍物鏡焦距很小,且物鏡鏡頭表面在物鏡套筒內,實驗中不容易測量物距,因而很難控制這一距離.2.2 節的實驗中,由物像變換關系實際得到物距w0=2.178 6 mm,算得樣品與焦距間的距離為29.1 μm.顯微成像關系要求物面位于系統2 倍焦距與焦距之間,若第一個衍射物面O1與樣品O0間的距離滿足了采樣公式要求,則第二個物面O2的位置不會處于樣品O0與焦距之間,而是位于焦距與透鏡之間,對應像面為虛像,因此導致無法恢復相位.

1.2 同時移動顯微物鏡與CCD的拍攝方法

為了使衍射物面間距既能滿足菲涅爾近似又能滿足采樣定理及成像位置的要求,本文提出一種固定像距,同步移動顯微物鏡及CCD 的拍攝方式,可以更方便地滿足上述采樣距離的要求.拍攝方法如圖3所示.

顯微系統的入射光源為相干平面波,照射樣品后,樣品的衍射花樣經顯微系統放大,由CCD 相機記錄物體放大衍射圖樣.O0面為樣品所在平面,首先用CCD 記錄其成像最清晰平面I0的強度信息.像面與顯微物鏡間的距離(Z)為像距,對應物面到顯微物鏡的距離(W)為物距.保持Z不變,將顯微物鏡與CCD 沿光場傳播方向同步向后移動Δd距離,采集第一個衍射物面O1的放大像面信息.拍攝完畢后,再次將顯微物鏡與 CCD 同步向后移動 Δd距離,記錄樣品的第二個衍射面O2面的放大像.O1、O2、O0三個衍射面間的距離為 Δd.本文的目標是由O1、O2面的強度分布重建O0面的相位分布.

圖3 拍攝方法示意圖

CCD 拍攝的衍射像是物面O1、O2的放大像,由于顯微系統的Z是固定不變的,因此拍攝的三個放大像相對于物面O0、O1、O2的放大倍率相同.原物面與其放大像的強度分布情況相同,但原衍射物面的像素大小需由物像面間的放大關系計算得出.將放大像面的像素尺寸除以顯微系統的放大倍率,就得到O0、O1、O2面的實際像素大小.顯微系統的放大倍率可利用已知尺寸的樣品來計算.拍攝樣品成像最清晰位置的放大圖像,將拍攝的樣品尺寸與實際尺寸相比,得到系統放大倍率(M).M=LI/LO,其中LI為拍攝尺寸,LO為樣品實際尺寸.拍攝尺寸LI=NΔξ,其中N表示樣品所占像素數量,Δξ表示CCD 單個像素尺寸.由放大像的像素大小 Δξ及系統放大倍率M,可計算出樣品所在平面O0及其衍射物面O1、O2面的像素大小 Δx =Δξ/M.

1.3 相位恢復方法

已知相鄰衍射面間隔距離Δd,計算出衍射物面O1、O2的像素大小 Δx,得到振幅分布即可由相位恢復方法重建O0面的相位分布.重建過程既可沿光場傳播方向由物體所在O0平面向O1、O2面傳播計算,也可由遠離物體的O2面向物體所在面O0反向傳播計算.物面O0與衍射面O1、O2間的傳播滿足菲涅爾近似條件.如果已知O2面的復振幅分布U2(ξ,η),那么O1面的復振幅分布可由菲涅爾變換表示為[17]：

O1、O0面的傳播過程也可同樣計算.公式(1)中U2(ξ,η)為O2面的復振幅分布,U1(x,y)為O1面的復振幅分布;z為傳播面間的距離;k為波數,k =2π/λ;脈沖函數為公式(1)也可寫作卷積形式[15]：

重建過程從衍射面O2開始,步驟如下：賦予O2面(-π,π)區間初始隨機相位分布φ2,與振幅值(IO2)1/2結合,得到面的復振幅分布U2=(IO2)1/2exp(jφ2).將復振幅U2從面傳播到O1面,由公式(2)計算得到面的復振幅A1exp(jφ1).將振幅A1替換為(IO1)1/2,保留相位分布φ1,合成新的復振幅U1=(IO1)1/2exp(jφ1).將U1傳播至O0面,同樣由公式(2)得到樣品所在平面的復振幅U0=A0exp(jφ0),其中相位φ0即為樣品的重建相位分布.

重建過程也可以由衍射面O0開始,由菲涅爾衍射依次計算光場傳播到O1、O2面的復振幅分布,并將計算振幅替換為測量振幅,最終將O2面的復振幅分布逆向傳播至O0面,提取相位信息得到重建相位分布.

2 相位顯微成像實驗

使用直徑5 μm 的單分散聚苯乙烯微球作為成像實驗的樣品.用移液槍吸取20 μL 樣本移入清潔的離心管中,加入2 mL 酒精試劑與樣本混合均勻,然后放入超聲波清洗器中超聲分散1 min.用滴管從離心管中吸取樣本,滴一滴在潔凈的載玻片上,用鑷子小心夾住蓋玻片邊緣輕輕蓋在樣品上,將蓋玻片與載玻片接觸的邊緣均勻的滴上密封膠隔絕空氣,制作好樣品裝片.

2.1 實驗過程及結果

搭建顯微系統,圖4為系統光路圖.激光器輸出波長632.8 nm,使用奧林巴斯物鏡(100 ×,NA =0.9),CCD(MV1-D2080-160-CL-12,photon focus)所拍圖像像素數2 080 ×2 080,像素大小 8 μm.由電動平移臺控制CCD 的移動過程,平移臺可移動的最大距離為15 cm,每步最小可移動0.1 μm.物鏡可以沿光場傳播方向調整前后位置,控制與樣品的距離.首先將CCD 調至成像最清晰的位置,采集此處的圖像.此時樣品與成像面間的距離約為150 mm.按照1.2 節所述拍攝方式,每次將CCD 和物鏡均沿傳播方向移動 Δd =50 μm 的距離,采集另外兩張衍射放大像.截取圖像512 ×512 大小的部分,見圖5(a)和5(b).

圖4 顯微系統光路圖

采集完畢后,測量3個微球直徑,計算出成像最清晰處圖像放大倍數為M=80.物面的像素大小為 8 μm/M=0.1 μm,利用O1和O2面的強度分布,由1.3 節所述相位恢復方法重建物體完整光場信息,結果見圖6(a)和6(b).

圖5 拍攝的像面.(a)CCD從焦面移動50μm所拍圖像;(b)CCD從焦面移動100μm所拍圖像

圖6(a)為重建的樣品相位信息,從相位分布情況可以清晰地看出微球厚度從中心到邊緣是徑向變化的.如果僅從圖6(c)樣品的強度分布上則無法觀測出有厚度分布變化的情況.如果得知樣品的折射信息,結合相位去包裹算法,可以應用于計算樣品的真實厚度值.

圖6 重建結果.(a)重建物體O處的相位;(b)重建物體O處的振幅;(c)CCD在成像最清晰位置的成像

2.2 與只移動CCD拍攝的成像結果對比

為了進一步佐證本文提出方法的有效性,對比了只移動CCD 拍攝成像的實驗結果,所用物像關系如圖7所示.拍攝焦面I0及與其相距 20 mm 及140 mm的放大像面I1、I2面,見圖8(a)和 8(b).Z0、Z1、Z2為 3個放大像面到物鏡的距離,W0、W1、W2為樣品及其衍射物面到物鏡的距離.像面與物面間的放大關系為Mi=Zi/Wi(i =0,1,2).物像關系測出焦面放大倍率M0=Z0/W0=74,樣品與焦面距離約為W0+ Z0=165 mm.解得W0=2.178 6 mm,Z0=162.8214 mm,焦距f=2.1498 mm.由物像關系計算每個物面與物鏡的距離W1=2.172 8 mm、W2=2.164 5 mm.三個物面的像素大小為 8 μm/M0=0.1 μm.O1、O2面間的距離為W1- W2=8.3 μm,O0與O1面的距離約為W0- W1=5.8 μm.解出M1、M2,算出I1、I2面與I0面的放大率比值Xi=Mi/M0(i =1,2),I1、I2面按照1/Xi縮放比例進行縮小,得到物面O1、O2的強度分布.由強度分布對物體進行相位恢復,重建結果如圖9所示.

圖7 移動CCD拍攝方法的物像關系示意圖

結果顯示,只移動 CCD 拍攝的成像方法,由1.1 節所述原因,在高倍大數值孔徑的顯微系統中并不能重建相位結果.結合2.1 及2.2 節的成像結果,證實了本文所提出顯微成像方法,應用于高倍大數值孔徑物鏡系統的有效性.本文所提出的拍攝方式,CCD 采集的三個放大像,因為像距相同,放大倍率是相同的.因此不必由物像關系計算每個物面與樣品的距離,省去了物像面縮放轉換的過程,與傳統移動 CCD 的拍攝方式相比,計算過程更加簡潔.

圖8 拍攝的像面與轉換后的物面.

圖9 僅移動CCD拍攝成像的重建結果.

3 結 論

本文通過將相位恢復與顯微成像相合,提出了一種適用于高倍物鏡顯微系統的相位顯微方法.由100 ×顯微系統,成功重建了5 μm 直徑微球樣品的相位分布,證實了所提出的相位顯微方法的有效性.該方法相對于干涉方法的顯微方法優勢在于光路及計算過程均更加簡便.本工作對于生物醫學樣品折射率或厚度分布計算具有實際應用意義.