超快激光制備生物醫用材料表面功能微結構的現狀及研究進展

張佳茹，管迎春,2,3,4*

(1.北京航空航天大學 機械工程與自動化學院，北京 100191；2.北京航空航天大學 大型金屬構件增材制造國家工程實驗室，北京 100191；3.北京航空航天大學 國際交叉研究院，北京 100191；4.北京航空航天大學 合肥創新研究院，合肥 230013)

1 引 言

生物材料(biomaterials)是指用于與生命系統接觸且發生相互作用的，能對器官、組織和細胞進行替換修復、診斷治療或誘導再生的一類人工合成或天然的特殊功能性材料，又稱生物醫用材料[1]。近年來已被廣泛應用于臨床診斷、修復、治療、或替代人體組織器官等[2]。隨著醫療水平的發展，對醫學材料及新的醫療設備提出了更高的要求，可植入人體的生物材料在現代醫學中的作用越來越重要。然而臨床結果顯示，幾乎所有的植入醫療器械都會在人體中產生不同程度的不良反應，包括纖維變性、炎癥、感染、血栓等[3-5]。為了提高醫療植入材料的安全性，生物相容性成為植入生物材料的基本要求。

生物相容性是指醫療植入材料在生物體內的動態變化過程中，能耐受宿主各系統的作用而保持相對穩定狀態、不被排斥或破壞的生物學特性，包括血液相容性和組織相容性[6]。人體組織對植入物進行的生物學反應，通常發生在材料與生物體接觸的界面，包括細胞表面-細胞外基質、細胞表面-植入材料表面等[7]。細胞是維持生命的基本單元，也是組織修復的基本物質[8]。因此，生物相容性的好壞不僅依賴于材料本身，還和與人體細胞直接接觸的材料表面的性能密切相關，包括材料表面的結構、成分、表面形貌、親疏水性及表面的能量狀態等[9]。通過生物、化學和物理等方法改善材料表面的性質，可以在不改變材料本身物理性能的前提下，大幅度提升醫療植入物與生物體的生物相容性。從材料學角度，生物材料表面的微結構決定了材料性能，所以可以通過在材料表面制備微結構影響細胞行為，從而改善植入物的生物相容性[10]。

1912年，Harrison等人[11]最早報道了通過材料表面微結構影響細胞行為。此后，大量研究開始著重于利用表面形貌來引導細胞的生長和發育。微制造技術為細胞行為的研究提供了重要手段，微制造表面的細胞行為在生物醫學研究方面發展快速[12]。近年來，超快激光已成功在醫用生物材料與器械的表面誘導微納結構影響細胞行為[13-15]，用于提高其生物相容性。已有研究在細胞對不同微納結構的反應方面取得了顯著的進步。本文簡單介紹了細胞與生物材料相互作用原理，綜述了近年來超快激光加工微納結構在生物材料領域的研究及其最新進展。

2 生物材料表面與細胞的相互作用

細胞生物學行為包括粘附、遷移、增殖、分化等。細胞的這些行為很大程度上依賴于周圍的微環境，包括細胞外基質(ECM)、相鄰細胞、可溶性生長因子和細胞因子等，它們均可被視為細胞賴以生存的“材料”[16-18]。通過在生物材料表面制造微納結構，來模仿細胞生長的自然環境，使細胞在與有機活體相似的環境中生長[19]。

當生物材料和細胞接觸時，材料表面首先吸附的是細胞外基質蛋白，如圖1所示[20]，它們能夠積聚到植入材料的表面形成結合牢固的吸附物，用于引導細胞粘附[21]。由圖1可知，生物材料通過表面吸附的蛋白，表面沉積的細胞外基質，表面的生物粘附片段，與細胞表面的整聯蛋白發生作用，介導細胞在生物材料表面的粘附。細胞在材料表面粘附后，進行爬行的行為，稱為細胞遷移[22]。細胞遷移大致包括4步如圖2所示。高等動物的傷口愈合、血液凝固、免疫應答、組織發育等多種生命活動都與細胞遷移運動密切相關。細胞在材料表面進行良好粘附后，會通過一系列有序的過程完成繁殖，其中干細胞在繁殖過程中，會受周圍環境影響分化為不同類型的細胞。此時，細胞的形狀不僅與外觀相關，而且與細胞的生存環境和功能活動密切相關。

圖1 細胞與合成材料粘附的控制機制[23]Fig.1 Mechanisms controlling cell adhesion to synthetic materials[23]

圖2 細胞遷移過程示意圖Fig.2 Schematic illustration of cell migration

3 激光加工微納結構對細胞行為的影響

在生物材料表面制造微納結構，模擬ECM真實形貌來控制細胞生物學行為，是提高材料生物相容性的有效手段。但傳統的微納米加工手段在結構靈活性、加工效率、成品率等方面，都存在較大缺陷，極大地限制了生物材料表面微結構制備技術的發展，表1給出了幾種不同典型微納加工方法制備生物材料的優缺點。近年來，通過超快激光制造出微納米級別尺寸的材料以改善材料的生物相容性，這種方法已被廣泛地應用于生物醫學領域。目前利用超快激光已成功在不同生物材料表面加工出如圖3所示的多種微納結構[24-28]。

表1 微細加工生物材料方法對比

圖3 超快激光加工的微納結構Fig.3 Periodic micro/nano structures fabricated by ultrafast laser

3.1 微納結構對細胞粘附的影響

當生物材料與人體組織直接接觸時，首先進行細胞粘附。研究表明，微納結構表面可以提供一種比平面表面更好的細胞附著點[44-47]。Ranella等人[48]利用波長為800 nm、脈寬為15 fs、頻率1 000 kHz的飛秒激光輻照硅片表面，通過改變激光的能量密度，獲得了具有不同表面粗糙度的微錐結構，如圖4所示。結果表明，在粗糙度比為2.6的情況下，纖維細胞對表面具有最佳的粘附性。不同類型的細胞，其生長特性不同，對最佳粘附粗糙度要求也不同。Alexandre等人[13]利用同樣方法在Ti-6Al-4V上加工微結構，并研究了其對人骨髓間充質干細胞的影響。結果顯示，拋光面更有利于細胞粘附。以上研究表明，不同細胞在不同材料表面達到最佳粘附時的表面粗糙度不同。

圖4 未經處理的硅片以及經過不同能量密度的飛秒激光處理的硅片表面微觀形貌圖(a)和在與(a)對應表面上，纖維細胞生長72 h之后的熒光顯微圖像(b)Fig.4 Microstructure topography of untreated Si wafers and wafers treated by femtosecond lasers with different energy densities(a) and fluorescence microscoy images(b) of fiber cells after 72 hours of growth on the corresponding surface (a)

血管支架植入是治療動脈硬化等血管疾病的有效手段。然而，血管支架植入后，由于血小板過度增殖會出現血栓、再狹窄等并發癥[49]。利用超快激光對支架表面進行修飾，控制細胞在支架表面的粘附，可有效避免血管支架植入后并發癥的產生。Clare等人[50]采用脈寬為500 fs、頻率為100 kHz、波長分別為1 030 nm及515 nm的飛秒激光，在不銹鋼表面誘導出周期為360 nm、深度為78 nm、粗糙度為29 nm及周期為730 nm、深度為142 nm粗糙度為48 nm的兩種激光誘導周期性表面結構(Laser Induced Periodic Surface Structures,LIPSS)，并研究了兩種周期結構對成纖維細胞(MS-5)和單核細胞(RAW 264.7)的影響，如圖5所示。結果顯示，粗糙度為幾納米的平面表面有利于RAW 264.7粘附，而MS-5更傾向粘附在粗糙度約為50 nm的LIPSS結構上。同時發現周期和深度的增加會降低細胞的粘附性。結果還表明，微結構表面不利于血細胞粘附，從而較少產生凝血的機會，提高了血管支架的血液相容性。

圖6 (a)SW10細胞培養在：(i)未處理硅表面，(ii)～(v)不同激光能量密度加工表面的細胞熒光圖；(b)培養3天后，SW10細胞在不同表面的數量Fig.6 (a)Fluorescence microscopy images of SW10 cells cultured on untreated Si(i), patterned Si substrates fabricated at different laser desities(ii-v). (b)Number of SW10 cells growing on the laser-patterned Si substrates for 3 days of culture(DOC)

材料表面的表面能、微結構類型等也是影響細胞在材料表面粘附的重要因素。Wang等人[51]使用波長為266 nm激光在聚苯乙烯上誘導出周期為250 nm，深度為60 nm的LIPSS結構。經過激光處理后材料的表面能是未處理表面的1.5倍。同時，微結構擴大了材料表面積，增加了蛋白質的吸附，顯著增強了細胞的粘附性能。Yiannakou等人[52]使用波長為800 nm、脈寬為150 fs、頻率為1 kHz的飛秒激光在硅上誘導出周期為146 nm的納米波紋結構和周期為140 nm，高度為2～11 nm的分層結構，如圖6所示。通過在不同微結構表面培養雪旺式細胞(SW10)，發現納米結構對細胞粘附起到了抑制效果，但分層的微納結構可顯著提升細胞的粘附性能。利用超快激光改變生物材料表面微納結構進而改善材料表面性能，是一種有效控制細胞粘附性能的方法。

3.2 微納結構對細胞遷移、定向的影響

大量組織都具有微米或納米尺度的拓撲結構，如心肌組織和血管呈現為有序排列的纖維狀結構，因此細胞的定向生長在醫療植入物功能組織中具有重要意義。細胞在植入物材料表面良好粘附后，可通過精確控制細胞在材料表面的遷移行為，實現類似于生物體組織器官細胞的分布和取向。目前超快激光微納制造技術已被用于模仿或構建類似于生物體內的細胞外環境，實現對細胞形態和分布的精準調控[53]。

圖7 培養48 h后，hMSC細胞在硅表面的細胞遷移，黑色區域為激光加工區域Fig.7 After 48 hours of culture, hMSC cells migration on the Si surface(dark areas are laser processing areas)

通過生物材料表面微觀結構控制成骨細胞排列對于實現骨骼各向異性至關重要。Wallat等人[54]利用波長為1 060 nm、脈寬為140 fs、頻率為80 MHz的飛秒激光在硅表面加工出周期為100 nm的LIPSS結構。hMSCs培養初期，細胞均勻分布在LIPSS區域和平面區域，48 h后，LIPSS區域的細胞向平面區域遷移，如圖7所示。研究表明激光微納加工可以有效引導骨細胞遷移，有助于實現骨的各向異性。心臟的本質特征是功能的各向異性，這一特征對維持心臟的機械活性、電活性及幫助血液從心臟有效泵出極為重要[55]。熱解碳作為人工心臟的優選材料，需要滿足功能的各向異性。目前St?pak等人[56]利用波長為1 030 nm、脈寬為450 fs、頻率為100 kHz及波長為1 064 nm、脈寬為15 ps、頻率為100 kHz的兩種超快激光器，在熱解碳材料上加工出90～860 nm的LIPSS結構，但能否通過其表面微納結構控制細胞定向排列，實現心臟功能的各向異性，有待進一步研究。

生物材料表面的拓撲結構特征是誘導細胞產生特定行為的關鍵因素，為了進一步觀察材料表面微納結構對細胞遷移定向的影響，Rusen等人[57]通過飛秒激光器(波長為775 nm、脈寬為200 fs、頻率為2 kHz的)在殼聚糖薄膜上制備了氣泡結構，并研究了不同氣泡結構尺寸對少突膠質細胞的粘附和定向生長行為的影響，結果如圖8所示?？梢姎馀莞叨刃∮?00 nm，對細胞行為幾乎沒有影響，當氣泡高度大于3 μm時，細胞早期的生長行為將受到影響。當氣泡間距大于40 μm時，細胞行為幾乎沒有受到影響，當氣泡間距在細胞長度范圍內(10～30 μm)時，細胞出現沿著氣泡方向生長的趨勢。但是這種影響只出現在細胞生長初期，細胞培養24 h后，由于細胞的融合，生長趨勢不明顯。

圖8 OLN細胞在(a)未處理表面；(b)不同高度氣泡結構表面;(c)高度200 nm的汽泡結構表面和(d)高度3 μm汽泡結構表面的細胞遷移。黑色箭頭顯示了細胞在最初的12 h內具有良好的方向性Fig.8 Optical microscopy images of OLN cells cultured on (a)unstructured control chitosan surface, on (b)bubbles like structures array, and with bubble height of 200 nm(c) and 3μm(d). Black arrows indicate the cell directionality encouraged in its early stages(first 12 h) on CS structures

圖9 (a)激光(532 nm)在200 nm聚苯乙烯薄膜上制備的周期為25 μm，深度分別為<4 μm、4～6 μm和>7 μm的溝槽結構；(b)平滑肌細胞培養在對應結構上的熒光圖Fig.9 (a)Groove structures with period of 25 μm and depth less than 4 μm, during in 4-6 μm, more than 7 μm, prepared by 532 nm laser on 200 nm polystyrene film; (b)fluorescence images of smooth muscle cells cultured on the groove structures

3.3 微納結構對細胞增殖分化的影響

生物材料的表面形貌影響細胞的增殖。Mutlu 等人[60]使用波長為1 035 nm、脈寬為200 fs、頻率為28 MHz的飛秒激光器在Ti-6Al-4V表面加工出寬度10 μm深度為5 μm的溝槽結構，培養人骨肉瘤細胞7天后，飛秒激光織構化的表面細胞增殖率可與經噴砂、酸腐蝕、光固化成型等商業處理的表面相媲美。同時發現，直徑為40 μm，深度為15 μm的凹坑狀表面，細胞粘附和增殖顯著減少，這種現象可能是由于細胞的生物力學導致的。凹坑的體積和細胞尺寸相當，細胞在凹坑中生長，承受凹坑壁對細胞的壓力，從而抑制了細胞的增殖。Sabrina等人[61]使用波長為800 nm、脈寬為35 fs、頻率為1 kHz的飛秒激光器在硅表面加工出高度為5.9 μm，間距4.8 μm的微錐結構，如圖10所示。將其培養成纖維細胞和神經母細胞瘤細胞48 h后。結果顯示，微錐結構對兩種細胞的增殖都有抑制作用，分析認為，這種微結構沒有為細胞生長提供足夠的接觸面，進而抑制了細胞的增殖。以上結果表明，通過超快激光制造不同的微結構可以有效控制細胞增殖。

圖10 硅表面的微錐結構(a)和細胞培養48 h后的增殖量(b)Fig.10 SEM images of spike structures fabricated on silicon(a) and the amount of profileration after 48 hours of cell culture(b)

細胞分化是指同一來源的細胞逐漸產生出功能特征、形態結構各不相同的細胞類群的過程。BMP-2和BMP-7經常作為骨誘導因子被用于促進干細胞分化成為成骨細胞。但潛在的不良反應及高昂的費用等因素催生了使用新方法促進成骨分化的需求。微納米結構作為一種信號形式引導細胞骨架重排，具有調控干細胞分化的潛能[62-63]。

Dumas等人[64]采用波長為800 nm、脈寬為120 fs、頻率為5 kHz的飛秒激光，在Ti-6Al-4V表面加工出直徑為30 μm，深度為800 nm的微坑結構和寬度600 nm，深度為200 nm的LIPSS結構。細胞培養結果顯示，兩種結構都能夠顯著提高間充質干細胞(MSCs)向成骨細胞轉變的能力，同時抑制向脂肪轉化。Alexandre等人[13]利用波長為1 030 nm、脈寬為500 fs的飛秒激光在Ti-6Al-4V上加工出LIPSS結構和微錐結構，如圖11所示。細胞在LIPSS及納米柱陣列表面呈同心狀堆疊在一起；在微柱及拋光表面，細胞則無序的堆疊。結果表明，材料表面的微納結構形貌有助于基質礦化及類骨結節形成，對細胞形狀會產生顯著影響。因此若能合理控制細胞外環境，尤其是植入體表面特性，對于提高和加速骨整合質量和形成速度至關重要。

圖11 細胞培養4周后，(a)細胞在未處理表面、LIPSS、NP和MC-LIPSS細胞熒光圖；(b)細胞培養在XO和OI中的熒光圖；不同基體的熒光強度：XO(c)和OI(d)Fig.11 (a)Fluorescence images of cell culture after 4 weeks, from left to right are for polished surface, laser-induced periodic surface structures, NP and microcolumn surfaces. (b)Fluorescence images of cells are cultured in XO and OI. Fluorescence intensities of XO(c) and OI(d). XO:Xylenol orange; OI:Osteo image

臨床研究也證實材料表面的微納結構有利于間充質干細胞分化為骨細胞，使植入物表面形成更多的骨生長[65-66]，有效改善種植體的骨整合。然而對于血管支架植入，血管內皮細胞或者平滑肌細胞在支架表面分化過快容易造成血管支架再狹窄[67]，因此抑制細胞分化同樣也是當今生物學研究的重點之一。Martin等人[68]采用脈寬為130 fs、頻率為1 kHz的飛秒激光器在不銹鋼表面分別制備出了間距分別為75、125和175 μm的點陣結構，如圖12所示。肌成纖維細胞分化實驗表明，與激光處理過的表面相比，細胞在未處理表面密度最高。結果表面，飛秒激光制造微結構可用于抑制細胞分化。在組織工程應用中，根據需求的細胞分化行為選擇合適的微結構至關重要。

圖12 (a)培養1天和3天后，肌成纖維細胞在不同基體上的密度；(b)肌成纖維細胞中等密度結構上生長出偽足；(c)肌成纖維細胞在未處理表面有大量偽足；(d)圖(c)偽足結束部位的放大圖Fig.12 (a)Myofibroblast[45]cell densities on the different substrates when cell cultured after one day and three days. (b)Myofibroblasts without filopodia growing on MD. (c)Myofibroblasts with extensive filopodia on non-treated steel. (d)Extract from (c): Detailed view on flattened regions at the filopodia endings(arrowheads). Non-treated, Low Density, Medium Density(MD) and High Density samples

4 結束語

綜上所述，材料表面的微納結構能夠影響細胞的定向、遷移及增殖分化等。同時，生物材料表面的微納結構可以通過改變細胞表面的應力分布，來影響細胞生長和凋亡。因此，研究生物材料的核心之一是模擬細胞微環境，通過仿生途徑設計制造生物材料，用于誘發特定細胞的生物學性能，從而提高醫用材料植入物的生物相容性。超快激光表面微納加工技術作為一種精密和超精密的微納制造技術，能夠模仿或構建類似于生物體內的細胞外環境實現對細胞形態和分布的精準調控[69-70]。

目前通過超快激光加工微結構對細胞行為進行控制還是靜態的，大部分研究還限于細胞偽足伸展方向的選擇上，不能完全涉及細胞遷移及運動的全過程，下一步可以通過超快激光技術與電化學或光化學方法相結合，通過表面微納結構與表面化學性質[71]的共同作用，實現微納結構對動態細胞的遷移和運動行為的實時監測。另一方面，多種細胞的共同培養對研究細胞間的信號傳導和相互作用十分重要，普通的基體很難實現幾種細胞的可控共培養，而且加工效率還有待進一步提高。超快激光具有簡單精確的特點，有望提供一種新型微納制造途徑，實現將微圖案應用于多種細胞的共培養。同時，在細胞尺度下，細胞與材料表面拓撲結構的相互作用機理仍未得到完全解釋，表面拓撲形貌的評價體系還有待完整地建立。生物相容性仍然是生物材料今后一段時期的研究重點，納米技術與材料的研發將是生物材料領域的熱點之一，利用超快激光的先進制造也將是生物材料及其制品今后的研發重點。