淀粉樣前體蛋白裂解片段sAPPβ、Aβ和AICD對SH-SY5Y細胞氧化損傷和線粒體膜電位的影響

陶鵬飛,姚晨赫,孫雅煊,孟欣怡,黃漢昌

(北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,中國北京100191)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以神經元丟失和腦萎縮為主要特征的中樞神經系統(central nervous system,CNS)退行性疾病,其臨床表現為記憶丟失、語言水平下降和行動能力受損[1～3]。AD主要的神經病理學特征之一是腦細胞外出現被稱為老年斑(senile plaque,SP)的淀粉樣斑塊,其主要成分為β-淀粉樣蛋白(amyloid βprotein,Aβ)。Aβ由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)經β-裂解途徑產生。AD確切的發病機制尚不明確。目前,被廣泛認同的“淀粉樣級聯假說”認為,大腦中Aβ異常聚集導致神經退行性病變,最后引發神經元的死亡。

APP的編碼基因位于人類第21號染色體長臂(21q21.3),至少由18個外顯子和17個內含子組成。該基因經轉錄翻譯后因剪切方式的不同,可形成至少8種長度不等的APP異構體,其中以APP695、APP751和 APP770較為常見,APP695主要表達于神經細胞[4～5]。細胞膜上的APP目前被認為主要經兩種途徑裂解。一方面,在細胞膜上的APP主要被α-分泌酶剪切,剪切位點為APP695序列的第612、613個氨基酸殘基(對應APP770序列的第687、688個氨基酸殘基)之間,產生可溶性的N端碎片sAPPα并釋放到細胞外,同時產生C端碎片CTFα(又稱C83)綁定于細胞膜上,隨后CTFα被γ-分泌酶剪切,生成Aβ17-40或Aβ17-42,以及胞內域片段AICD[6～7]。由于γ-分泌酶剪切位點位于Aβ氨基酸殘基之間,因此沒有Aβ的生成,這一剪切途徑被稱為非淀粉樣途徑[8～10]。另一方面,細胞膜上的部分APP通過依賴網格蛋白的內吞作用迅速內化,并被運輸到核內體(endosome)或者反式高爾基體。在此,APP首先被β-分泌酶在APP695序列的第596、597個氨基酸殘基(對應APP770序列的第671、672個氨基酸殘基)之間剪切,產生N端片段sAPPβ和C端片段CTFβ(又稱C99),隨后CTFβ 被 γ-分泌酶剪切,生成 Aβ1-40或 Aβ1-42,以及胞內域片段AICD,此過程被稱為淀粉樣途徑[5,11～13]。

有研究表明,Aβ異常聚集可導致細胞內神經原纖維纏結(neurofibrillary tangle,NFT)的形成、內質網氧化應激、線粒體功能障礙等,隨后引發神經元丟失[10,14]。值得注意的是,內源性Aβ片段的生成也伴隨著sAPPβ、AICD片段的產生。本研究利用慢病毒介導DNA轉染的方法,分別構建了過表達sAPPβ、Aβ和AICD片段的 SH-SY5Y細胞系,并考察了其對細胞氧化損傷和線粒體膜電位去極化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

過表達sAPPβ、Aβ和AICD片段的SH-SY5Y神經瘤細胞由本實驗室自行構建。將表達sAPPβ、Aβ和AICD蛋白片段(分別為APP蛋白的18～596、597～638和639～695氨基酸殘基)的基因編碼序列構建到質粒表達載體pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A中,包裝成慢病毒顆粒。

High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司;TRIzol?Reagent試劑盒購于美國Ambion公司;抗sAPPβ抗體(A8967)購于美國Sigma-Aldrich公司;抗AICD抗體(A8717)購于美國Sigma-Aldrich公司;抗Aβ抗體(Ab2539)購于英國Abcam公司;抗β-actin抗體(A1978)購于美國Sigma-Aldrich公司;細胞增殖-毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)購于日本Dojindo公司;乳酸脫氫酶 (lactate dehy drogenase,LDH)測定試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司;活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)購于美國Genview公司;辣根酶標記的山羊抗兔IgG(IH-0011)購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司;辣根酶標記的山羊抗鼠IgG(IH-0011)購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司;新霉素(G418)購于美國Genview公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染

將人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞均勻接種于培養皿中,加入5 mL含血清和雙抗的培養基[basal medium/DMEM/F 12(1︰1)培養基+10%胎牛血清+1%鏈霉素-青霉素溶液]。細胞培養于37℃、5%CO2培養箱中,3～4 d傳代1次。將SH-SY5Y細胞按1×105個/孔均勻接種于6孔板中,24 h后將培養液換成不含雙抗的培養液,繼續培養4 h。取其中一孔計數,按照感染復數(multiplicity of infection,MOI)=5,分別將攜帶目的基因sAPPβ、Aβ和AICD質粒的慢病毒顆粒以及不含目的基因的空質粒慢病毒顆粒加入細胞培養液。將細胞分為5組:1)空白對照組,即正常SH-SY5Y細胞;2)sAPPβ細胞組,即過表達sAPPβ片段的SH-SY5Y細胞;3)Aβ細胞組,即過表達Aβ片段的SH-SY5Y細胞;4)AICD細胞組,即過表達AICD片段的SH-SY5Y細胞;5)陰性對照組,即表達空質粒的SH-SY5Y細胞。

1.2.2 新霉素篩選轉染組細胞和細胞熒光蛋白的表達

質粒載體包含熒光蛋白表達基因EGFP和新霉素(G418)抗性基因。細胞轉染24 h后,加入含5%G418的篩選培養基,成功篩選的細胞經擴大培養得到穩定轉染的細胞。將穩定轉染的細胞置于熒光顯微鏡下,曝光時間1 ms拍攝明場照,曝光時間200 ms拍攝熒光照。

1.2.3 RT-PCR分析目的基因的mRNA表達

將穩定轉染的5組SH-SY5Y細胞分別以2×105個/孔接種于Φ3 cm培養皿中,24 h后采用TRI-zol?Reagent試劑盒提取細胞總RNA。利用酶標儀在260/280 nm下測定總RNA吸光度(260/280 nm吸光度比值在1.6～1.8)。將總RNA通過High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒反轉錄成cDNA,采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,RT-PCR)擴增cDNA,主要參數如下:5℃變性15 min;3步循環,即95℃ 15 s、54℃30 s、72℃45 s,循環數為40。目的基因引物如表1所示。

1.2.4 Western-blot分析目的蛋白片段的表達情況

將穩定轉染的5組SH-SY5Y細胞分別以5×105個/孔接種于Φ3 cm培養皿中,24 h后提取細胞總蛋白質,Western-blot檢測各組細胞目的蛋白片段的表達情況。操作方法:細胞用PBS洗滌兩遍,每個培養皿加入120 μL含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,4℃下收集細胞,13 000 g離心15 min。BCA法測定總蛋白質濃度。15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electropheresis,PAGE)分離不同相對分子質量的蛋白質并轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上;5%脫脂奶粉封閉1 h,4℃下一抗孵育過夜;經TBST緩沖液洗滌后常溫條件下二抗孵育2 h;增強型化學發光液(enhanced chemiluminescence,ECL)測定蛋白質條帶光密度值,并用軟件Quantity One分析條帶灰度值。

1.2.5 CCK-8法測定細胞存活力

采用CCK-8法測定細胞存活力,CCK-8中的主要成分WST?-8能被細胞內的脫氫酶還原為水溶性的橙黃色甲臜,生成甲臜的量與細胞數成正比,可間接測定活細胞數量。將5組SH-SY5Y細胞以1×104個/孔分別接種于96孔板中,培養24 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,置于37℃含5%CO2的培養箱中培養4 h。于波長450 nm(參比波長630 nm)下酶標儀測定OD值,OD值/每孔細胞數得到細胞相對存活力,單位為OD/104個細胞。

1.2.6 乳酸脫氫酶(LDH)活力測定

將5組SH-SY5Y細胞分別以1×104個/孔接種于96孔板中(細胞懸液為每孔100 μL),培養24 h,按照LDH測定試劑盒操作說明測定培養基中的LDH活力。正常情況下LDH存在于細胞質中,當細胞膜受到損傷時,LDH會釋放到培養基中,通過檢測培養基中LDH的酶活性可以反映細胞膜的損傷程度。LDH酶活性測定原理:LDH可催化NAD+生成NADH,NADH和碘硝基氯化四氮唑藍(2-p-iodophenyl-3-nitrophyltetrazolium chloride,INT)經硫辛酰胺脫氫酶催化反應生成NAD+和強生色物甲臢,后者于490 nm波長處產生吸收峰。實驗中用酶標儀測定OD值,OD值/每孔細胞數得到細胞LDH相對活力,單位為OD/104個細胞。

1.2.7 細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平測定

將5組SH-SY5Y細胞分別以1×104個/孔接種于96孔板中,培養24 h,加入無熒光的二氯二氫熒光素二乙酸酯(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA)探針(終濃度為 10 μmol/L)。DCFH-DA可自由穿過細胞膜,在細胞內被酯酶水解為DCFH,不能穿過細胞膜的DCFH在細胞內被活性氧氧化為有熒光的DCF。DCFH-DA探針孵育細胞20 min后用無血清培養液洗滌細胞3次,采用熒光酶標儀測定OD值(激發波長502 nm,發射波長530 nm),OD值/每孔細胞數得到細胞內活性氧相對水平,單位為OD/104個細胞。

表1 RT-PCR所用引物序列Table 1 Primers for RT-PCR

1.2.8 線粒體膜電位測定

將5組SH-SY5Y細胞分別以1×104個/孔接種于96孔板中。培養24 h后吸除培養液,每孔加入100 μL無血清培養液和100 μL JC-1染色工作液,充分混勻,于細胞培養箱中37℃下孵育20 min。吸除上清,用JC-1染色緩沖液洗滌2次,每孔加入100 μL無血清培養液,采用熒光酶標儀測定熒光強度。線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物,產生紅色熒光;線粒體膜電位較低時,JC-1不能聚集在線粒體基質中,此時JC-1為單體,產生綠色熒光。JC-1單體最大激發/發射波長為514 nm/529 nm,聚合體最大激發/發射波長為585 nm/590 nm。采用熒光酶標儀分別測定聚合物和單體的OD值,(ODred/ODgreen)/細胞個數表示線粒體膜電位去極化的程度。

1.3 數據分析

實驗中各項指標測定均至少重復3次,采用IBM SPSS Statistics軟件進行實驗數據的統計分析。實驗數據以平均值±標準差(±s)表示,組間數據比較采用獨立樣本t檢驗,P＜0.05視為差異有顯著性。Sigma Plot計算機軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 細胞形態及熒光蛋白表達

從細胞EGFP熒光蛋白的表達可以看出,空白對照組SH-SY5Y細胞無明顯熒光(極微弱的熒光可視為細胞自發熒光),而轉染組細胞均可見熒光(圖1 a～e),初步表明質?；蚪M已成功整合到宿主細胞,并表達了熒光蛋白。與空白對照組SH-SY5Y 細胞(圖 1A)相比,Aβ 組(圖 1C)和 AICD組(圖1D)的細胞突觸變短,胞體收縮,初步表明轉染Aβ或AICD基因后,SH-SY5Y細胞形態受到一定的影響。

2.2 RT-PCR檢測目的基因mRNA表達

目的基因導入宿主細胞后是否表達,首先要確定目的基因是否能轉錄為mRNA。在RT-PCR的結果處理中,將循環閾值設為0.1,得到各組細胞Ct值,根據相對定量法:目的基因相對表達量=2-△△Ct,得到各轉染組細胞目的基因相對表達量。結果如圖2所示,與空白對照組和陰性對照組細胞相比,sAPPβ、Aβ和AICD組細胞中目的基因相對表達量均顯著升高(P＜0.05),表明轉染sAPPβ、Aβ和AICD基因的細胞成功過表達了sAPPβ、Aβ和AICD基因,這在mRNA水平上確定了目的基因已成功導入宿主細胞,并能夠轉錄相應的mRNA。

圖1 細胞形態及熒光圖(A)空白對照組細胞明場圖;(a)空白對照組細胞熒光圖;(B)sAPPβ細胞組明場圖;(b)sAPPβ細胞組熒光圖;(C)Aβ細胞組明場圖;(c)Aβ細胞組熒光圖;(D)AICD細胞組明場圖;(d)AICD細胞組熒光圖;(E)陰性對照組細胞明場圖;(e)陰性對照組細胞熒光圖。Fig.1 Morphological and fluorescence images of cells in each group(A)White light of control group;(a)Fluorescence of control group;(B)White light of sAPPβ group;(b)Fluorescence of sAPPβ group;(C)White light of Aβ group;(c)Fluorescence of Aβ group;(D)White light of AICD group;(d)Fluorescence of AICD group;(E)White light of negative control group;(e)Fluorescence of negative control group.

2.3 Western-blot分析目的蛋白片段的表達情況

進一步在翻譯水平研究目的基因的表達情況。結果如圖3所示,與空白對照組和陰性對照組細胞相比,分別轉染sAPPβ、Aβ和AICD基因的細胞中sAPPβ、Aβ和AICD蛋白片段的表達水平均顯著升高(P＜0.05),表明轉染sAPPβ基因的細胞過表達了sAPPβ蛋白片段,轉染Aβ基因的細胞過表達了Aβ蛋白片段,轉染AICD基因的細胞過表達了AICD蛋白片段。

2.4 過表達 sAPPβ、Aβ和 AICD基因對 SHSY5Y細胞存活力的影響

為了研究APP的β裂解片段sAPPβ、Aβ和AICD對細胞生長的影響,本研究進一步考察了轉染目的基因后細胞的存活力。結果如圖4所示,與空白對照組細胞相比,陰性對照組細胞的存活力無顯著差異,表明載體基因組轉染到宿主細胞基因組后,宿主細胞的相對存活力不受影響;與空白對照組和陰性對照組相比,轉染sAPPβ、Aβ和AICD基因后細胞的相對存活力均顯著下降(P＜0.05)。以上結果表明過表達 sAPPβ、Aβ或AICD基因后,SH-SY5Y細胞的存活力在一定程度上會降低。

2.5 過表達 sAPPβ、Aβ和 AICD基因對 SHSY5Y細胞膜損傷的影響

圖2 目的基因的mRNA相對表達水平(n=3)*:與空白對照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.2 The relative expression levels of transfected target genes(n=3)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

圖3 sAPPβ、Aβ和AICD蛋白片段的相對表達量(n=3)*:與空白對照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.3 The relative expression levels of sAPPβ,Aβ and AICD fragments(n=3)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

圖4 細胞相對存活力(n=7)*:與空白對照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.4 The relative cell viability(n=7)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

圖5 細胞培養液中的LDH相對活性(n=7)*:與空白對照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.5 The relative level of LDH in culture medium(n=7)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

細胞膜的完整程度與細胞凋亡和細胞損傷密切相關,本研究通過檢測細胞培養液中LDH的活性,定量分析sAPPβ、Aβ和AICD片段對細胞的毒性作用。結果如圖5所示,與空白對照組相比,陰性對照組培養液中LDH活力上升(P＜0.05),表明載體質粒轉染宿主細胞基因組后,宿主細胞的細胞膜受到一定程度的損傷。此外,與空白對照組和陰性對照組相比,轉染sAPPβ基因的細胞培養液中LDH活力均沒有顯著差異,而轉染Aβ和AICD基因的細胞培養液中LDH活力均顯著提高(P＜0.05)。以上結果表明,sAPPβ片段不會對細胞膜產生明顯損傷,而Aβ和AICD片段則會造成細胞膜的顯著損傷。

2.6 過表達 sAPPβ、Aβ和 AICD基因對 SHSY5Y細胞內ROS的影響

活性氧包括超氧自由基、過氧化氫及其下游產物過氧化物和羥化物,參與包括細胞增殖、發育、衰老和凋亡在內的許多生理和病理過程。本研究中各組細胞的胞內ROS水平測定結果如圖6所示,與空白對照組相比,陰性對照組細胞內ROS的活性無顯著差異,表明載體基因組整合到宿主細胞基因組后,胞內ROS的水平不受影響。但是,與空白對照組和陰性對照組細胞相比,Aβ和AICD基因轉染組細胞內ROS的水平均顯著上升(P＜0.05),這說明過表達Aβ和AICD片段會導致細胞內ROS活性上升,引發細胞氧化應激反應。

圖6 細胞中ROS相對活性(n=6)*:與空白對照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.6 The relative activity of intracellular ROS(n=6)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

2.7 過表達 sAPPβ、Aβ和 AICD基因對 SHSY5Y細胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。本研究中各組細胞的線粒體膜電位測定結果如圖7所示,與空白對照組SH-SY5Y細胞相比,陰性對照組細胞的胞內線粒體膜電位相對水平無顯著差異,表明載體質粒轉染宿主細胞后,胞內線粒體膜電位水平不受影響。同時,與空白對照組和陰性對照組細胞相比,轉染Aβ和AICD基因的細胞中線粒體膜電位相對水平均顯著降低 (P＜0.05),這表明過表達Aβ和AICD片段能夠引發細胞線粒體膜電位的去極化作用。

3 討論

本實驗通過慢病毒介導基因轉染的方法,成功構建了分別過表達sAPPβ、Aβ和AICD片段的SH-SY5Y細胞系。首先,G418篩選和EGFP熒光蛋白的檢測均證明載體基因組已成功整合到宿主細胞基因組,并且整合后基因組中的新霉素抗性基因和熒光蛋白基因EGFP均已成功表達;其次,我們從mRNA水平和蛋白質水平證明各轉染組細胞中目的基因成功地進行了轉錄和翻譯。

圖7 細胞線粒體膜電位相對水平(n=4)*:與空白對照組相比,差異顯著(P＜0.05);#:與陰性對照組相比,差異顯著(P＜0.05)。Fig.7 The relative level of mitochondrial membrane potential(n=4)*:Compared with control group,the difference is significant(P＜0.05);#:Compared with negative control group,the difference is significant(P＜0.05).

研究顯示,sAPPβ片段不僅能夠降低原代神經元細胞的黏附作用,促進細胞突觸的增長[15],而且還能誘導人胚胎干細胞快速分化[16]。因此推測sAPPβ片段無細胞毒性。本實驗結果顯示過表達sAPPβ片段對SH-SY5Y細胞系的細胞膜、胞內ROS和線粒體膜電位均無顯著影響,這也表明sAPPβ片段無細胞毒性。

已有研究報道,外源性Aβ1-42通過引發內質網應激誘導內皮細胞損傷和凋亡,并上調caspase-12和caspase-3等凋亡因子的水平[17]。線粒體膜電位下降與細胞凋亡的發生密切相關,線粒體損傷導致細胞色素c、caspase-3和bax等促凋亡因子的釋放,進而激活caspase級聯效應,最終引發細胞凋亡[18～19]。本實驗通過慢病毒轉染構建過表達Aβ片段的SH-SY5Y細胞模型,在此模型的基礎上證明內源性Aβ片段可導致SH-SY5Y細胞膜損傷、線粒體去極化、胞內ROS升高和細胞活力降低。

腦啡肽酶(neprilysin,nep)可降解內源性Aβ,降低腦內Aβ水平,而AICD片段可與nep的啟動子區域結合,最終降低nep的表達與活性[20～21]。前腦和海馬神經元過表達AICD片段的轉基因小鼠顯示出多種AD病理特征,包括tau蛋白過度磷酸化、海馬三突觸回路功能異常、記憶功能損傷[22～23]。本實驗結果表明,過表達AICD片段可在一定程度上引起SH-SY5Y細胞活力下降、細胞膜受損、胞內ROS水平升高和線粒體膜電位發生去極化。