芽胞桿菌屬產α-淀粉酶的研究進展

徐挺亮,唐詩哲,彭 晶,陳行鋼,朱玉玲,周凱燕,周洪波

(中南大學資源加工與生物工程學院,中國湖南長沙410083)

酶是一種主要以微生物為來源的人類需求產品。其中,淀粉酶是能夠水解淀粉和糖原的一類酶的統稱,它是最早實現工業應用生產,也是迄今產量最大、用途最廣的一種酶制劑[1]。根據淀粉酶水解淀粉作用的糖苷鍵和反應產生的糖端基團的不同,可將淀粉酶分為四大類:α-淀粉酶,系統名稱為1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶,是一種從內部隨機切開淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子的α-1,4糖苷鍵的內切型淀粉酶;β-淀粉酶,從底物還原性末端每相隔一個的α-1,4糖苷鍵順次水解;葡萄糖淀粉酶,從底物非還原性末端順次水解α-1,4糖苷鍵和分枝點α-1,6糖苷鍵,生成葡萄糖分子;異淀粉酶,只水解糖原或支鏈淀粉分枝點α-1,6糖苷鍵,從而切下側枝[2]。其中,α-淀粉酶是我國目前用途最廣、產量最大的工業酶制劑種類之一,同時也是淀粉工業中最為重要的水解酶之一,在酶制劑生產中占有重要地位,在淀粉加工業、紙漿制造、紡織工業、釀造酒精及飼料加工業等領域廣泛應用[2～3]。

盡管α-淀粉酶可以來源于多種生物,包括動物、植物和微生物,但是滿足工業化生產需求的α-淀粉酶通常從微生物中獲得。目前,工業上生產的α-淀粉酶主要來源于5種常見的微生物,包括解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)[4]。其中,芽胞桿菌屬(Bacillus spp.)是α-淀粉酶主要的工業生產菌屬。

芽胞桿菌屬是一類好氧或兼型厭氧的、能夠產生抗逆性芽胞的桿狀細菌,一般為革蘭氏陽性,主要分布于土壤、植物體表以及水體中。其內生孢子狀態對熱、紫外線、電磁輻射和部分化學藥品均具有很強的抗性[5]。芽胞桿菌是工業中十分常用的酶制劑生產菌株,一般能夠分泌許多種胞外產物,如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶及脂肪酶等[6]。盡管研究發現大多數芽孢桿菌可以產生胞外淀粉酶,但目前用于工業生產α-淀粉酶的芽胞桿菌菌株主要是解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)和枯草芽胞桿菌(B.subtilis)[4]。其他芽胞桿菌如嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)等也有作為α-淀粉酶生產菌株的報道[7～9]。

在傳統的芽胞桿菌屬工業生產α-淀粉酶中,由于處理步驟、溫度控制和pH等環境因素易于調控等優勢,液體深層發酵(submerged fermentation,SmF)是發酵方法的首選。而近年來,α-淀粉酶的固態發酵(solid state fermentation,SSF)也已經取得了很大進展,正逐漸取代傳統的SmF[4]。

本文綜述了國內外目前主要用于α-淀粉酶工業生產的芽胞桿菌屬菌株、發酵培養基及部分的發酵參數,梳理了產α-淀粉酶芽胞桿菌的菌種選育的發展過程及當前新型的育種手段,可為α-淀粉酶工業菌株選育和發酵生產提供新參考。

1 α-淀粉酶的種類和性質

隨著工業的不斷發展,人們對不同特性的α-淀粉酶的需求量不斷增加,研究者們目前已經篩選并鑒定了上百種不同的α-淀粉酶[4]。根據最適作用溫度的不同,α-淀粉酶可以分為耐高溫、中溫和低溫3種類型。

1.1 耐高溫α-淀粉酶

在目前的淀粉糖工業制備中,由于一般是在105～118℃的高溫環境下進行淀粉噴射液化,所以α-淀粉酶的熱穩定性對下游產業的應用極為重要[10]。早在1973年,Saito等[11]對一株地衣芽胞桿菌分泌的耐高溫α-淀粉酶(B.licheniformis αamylase,BLA)的特性進行了詳細的研究。結果顯示:該酶的相對分子質量為22.5 kD,具有廣泛的pH適應范圍,最適反應pH和溫度分別為9.0和76℃。之后,林劍等[12]對B.licheniformis HM-3產生的BLA進行了酶學性質研究,發現其最適反應pH為6.1～7.0;最適溫度范圍為75～85℃。張強[13]也報道了B.licheniformis Z-8所產BLA的最適反應pH和溫度,分別為6.0和95℃。

產耐高溫α-淀粉酶的菌株主要是芽胞桿菌屬的微生物,如地衣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、凝結芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌。同時,也有一些鏈球菌和古細菌產耐高溫α-淀粉酶[14]。但目前工業生產上常采用地衣芽胞桿菌及其突變株。地衣芽胞桿菌適合生長和發酵的溫度均比較高,一般發酵溫度達42℃,部分地衣芽胞桿菌菌株的最適發酵溫度甚至高于45℃[15]。

1.2 中溫α-淀粉酶

中溫耐熱型α-淀粉酶作用的最適溫度為50～70℃,90℃以上的處理一般會使其失活,而非耐熱性α-淀粉酶作用的最適溫度為50℃左右。在烘焙行業中,過量的α-淀粉酶常常會導致面包過粘,而中溫α-淀粉酶能夠在其淀粉糊化時具有活性,在焙烤過程中則逐漸失活,最終在焙烤完成時喪失活性[16]。因此,中溫α-淀粉酶在面包烘焙行業中具有不可替代的作用。

在淀粉酶制劑工業上,B.amyloliquefaciens BF7658菌株及以此菌株為基礎獲得的重組、突變菌株是主要的中溫α-淀粉酶生產菌株[2]。其中,中溫α-淀粉酶基因主要來源于兩種芽胞桿菌:解淀粉芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌,二者產生的中溫α-淀粉酶分別被稱為解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶(B.amyloliquefaciens α-amylase,BAA)和枯草芽胞桿菌 α-淀粉酶(B.subtilis α-amylase,BSA)。這兩種α-淀粉酶的理化特性有著明顯的區別:BAA屬液化型,而BSA為糖化型。相比之下,BAA的酶學性能略優于BSA,是市場和工業應用中的主要酶種[17]。劉洋等[18]對 B.amyloliquefaciens M23 產生的BAA進行了一系列酶學性質檢測,結果顯示:該酶的相對分子質量為58 kD,最適反應溫度為55℃,最適反應pH為6.0;在55℃條件下保溫15 min基本喪失活力,而在添加10 mmol/L的Ca2+條件下能顯著提高酶的熱穩定性。目前,一般工業應用中BAA的相對分子質量大多在50～60 kD,在40～60℃范圍內有較高的穩定性,其最適作用溫度約為60℃,最適作用pH為6.0～7.0,并且其酶活對Ca2+有很強依賴,在弱堿環境下較為穩定[2]。由于生產BAA的解淀粉芽胞桿菌發酵最適溫度較低,一般需控制在34℃以下,所以該菌發酵過程中將耗費大量冷卻用水[17]。

1.3 低溫α-淀粉酶

淀粉是單胃動物能量的主要來源,幼齡動物由于消化系統發育不成熟,淀粉酶往往分泌不足,此時通過補充外源性營養消化酶能夠在一定程度上彌補該缺陷。然而動物生理環境溫度一般為37～42℃,中溫α-淀粉酶在動物消化道內可發揮的作用甚微[19]。低溫α-淀粉酶的最適作用溫度相對于中溫α-淀粉酶要低20～30℃,在0℃下仍具有一定的活性,適合作為動物外源性營養消化酶。此外,低溫α-淀粉酶也廣泛用于饅頭制作等過程[20]。

低溫α-淀粉酶在枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌等菌種中均有報道[21～23]。Ikawa等[24]分離到一種來源于枯草芽胞桿菌,以不同的水解效率水解可溶性淀粉、支鏈淀粉、糖原、直鏈淀粉、葡聚糖等多種底物的低溫α-淀粉酶,其相對水解率(可溶性淀粉為100%)分別為100%、133%、94%、39%、12%。該酶在45℃下十分穩定,但在60℃下幾乎完全失活。2017年,竇少華等[25]發現了一株來源于海洋的產低溫α-淀粉酶的菌株Bacillus thuringiensis dsh19-1,該菌株的最適生長溫度為20℃,發酵粗酶液最適作用溫度為20℃。由于低溫α-淀粉酶成本高于目前的商業用酶,因此該酶在應用推廣上還存在一定的困難[26]。

2 生產菌株選育研究現狀

2.1 誘變育種

誘變育種作為工業菌株育種的重要方法之一,它具有操作簡便、速度快、收效大等優勢。經過對菌株不斷地誘變改良,目前工業上所用菌種產生α-淀粉酶的能力得到了很大的提高。潘風光等[27]認為,誘變處理能夠改變或破壞芽胞桿菌中部分酶的合成調控機制及其分泌調節機制,首先篩選出抗代謝阻遏的突變株或者蛋白質分泌能力提高的突變株,隨后通過多輪誘變處理,逐漸積累有益的、有效的基因突變位點,最終獲得α-淀粉酶高產突變菌株。傳統的物理、化學誘變方法有紫外誘變法、亞硝基乙基脲法、甲基磺酸乙酯法等。近年來,許多新型的誘變方法被用于芽胞桿菌以提高其酶產量或改變菌株特性。例如:Cregenzán-Alberti等[28]利用高溫脈沖電場誘變處理B.subtilis DSM618的內生孢子,得到的突變株在123℃的條件下更具耐熱性;Ma等[29]報道,通過常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變包含有重組質粒的B.subtilis 168,重組質粒中堿性α-淀粉酶的產酶效率從1.31 U/(mg·h)增加至1.57 U/(mg·h);Ma等[30]還利用ARTP方法對B.subtilis WB600菌株進行誘變處理,發現其α-淀粉酶活力較出發菌株提高了35%;趙天惠等[31]利用脈沖強光誘變,經初篩和復篩,獲得了兼具耐受高溫、強酸、高濃度鹽的變異菌株B3和B7,其產出的α-淀粉酶的酶活比原始菌株分別提高了67%、77%;鄢洪德等[32]采用超臨界CO2誘變B.subtilis K2,發現其所產淀粉酶的活力提高了33%。盡管誘變能夠獲得酶活較高和耐受性較強的突變株,但誘變菌株的穩定性一般較差,需要經過傳代檢驗以保證其性質能夠遺傳[27]。另外,由于誘變后同時存在著大量的正、負突變,所以為了快速獲得酶活提高很大的突變菌株,高通量篩選方法的建立才是誘變育種需解決的關鍵問題。

2.2 基因工程育種

基因工程育種可通過將外源遺傳物質導入受體細胞的方式或通過對菌種自身基因的精確修飾來達到功能性目的,是在分子水平上對工業微生物菌種進行的遺傳操作[33]。迄今,構建基因工程菌株進行發酵產α-淀粉酶的例子已經越來越多。

早在1978年,Nomura等[34]就使用基因工程技術將整合有amyE基因的質粒轉化枯草芽胞桿菌,得到具有產α-淀粉酶能力的轉化菌株。1981年,Palva等[35]使用pUB110作為運載體將來源于B.amyloliquefaciens的α-淀粉酶基因克隆到B.subtilis中,篩選出了抗卡拉霉素的B.subtilis基因工程菌株,由于基因拷貝數和質粒上啟動子的改變,其α-淀粉酶活力比原始的野生型菌株高500倍。1987年,Vehmaanper?等[36]也成功克隆了 BAA酶基因,將其進行重組后獲得了B.subtilis ALKO-84,并用于工業化生產α-淀粉酶。由于游離質粒存在無抗生素壓力下易丟失的特點,在生產過程中需要投入較多相應的抗生素。1998年,王磊等[37]建立了一套整合載體,將來自嗜熱脂肪芽胞桿菌的高溫α-淀粉酶基因以及一段氯霉素抗性基因隨機整合到B.subtilis 1A289的染色體上,并通過提高菌株的抗氯霉素能力以及重復地進行整合步驟,不斷提高整合到染色體上高溫α-淀粉酶基因的拷貝數,最終將拷貝數增至7個以上。在無抗生素選擇壓力的情況下,該菌種仍能保持產酶220 U/mL。相較游離質粒型的基因工程菌,該菌產酶穩定性良好,從根本上克服了早期質粒型基因工程菌的質粒易丟失的現象。2009年,牛丹丹等[38]將α-淀粉酶編碼基因amyL導入BLA生產菌中,使該菌α-淀粉酶的產量提高了約89.2%。此外,2017年,李由然等[39]成功實現了由新興的CRISPR/Cas9基因編輯系統介導的B.lichenifor-mis ATCC14580淀粉酶編碼基因amyL的敲除,在該菌絕大多數α-淀粉酶喪失活性的條件下,其生長速率仍未受到顯著影響。李由然團隊將CRISPR/Cas9系統成功運用于地衣芽胞桿菌基因組的編輯,為應用這種新型的基因編輯工具于該菌基因功能研究及菌種改造提供了參考。

3 發酵研究現狀

芽孢桿菌屬工業化生產α-淀粉酶的大規模發酵制備方法主要分為兩種:液體深層發酵和固態發酵[40]。

3.1 α-淀粉酶的液體深層發酵

通常,由于液體發酵具有對溫度、pH、通氣量、溶氧和水分等過程參數控制方便,使用商業化的培養基配方,滅菌和最終產品的純化過程容易等優點,工業上優先選用液體深層發酵來對微生物酶制劑進行大規模的生產。但是,這種方法對底物消耗較快,需要在發酵過程中不斷進行流加補充[4]。早在1917年,一種來自枯草芽胞桿菌的α-淀粉酶就被認為是適應工業化生產的酶。但直到1950年左右,這種酶才開始進行商業化生產,并借鑒和引入了當時抗生素工業常用的液體發酵[41]。α-淀粉酶是一種誘導酶,通常在淀粉或者其水解產物存在的條件下被誘導。芽胞桿菌屬中不同菌種對培養基中不同的底物具有特異性。例如:對于工業生產中溫α-淀粉酶常用的B.amyloliquefaciens BF7658,其誘導效果依次是可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇、阿拉伯糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖[42]。此外,李志鵬[2]對B.amyloliquefaciens YL1-5(B.amyloliquefaciens BF7658變異株)的發酵培養基進行了優化,優化后的培養基為玉米粉16%、棉籽餅粉8%、玉米漿粉1.0%、沸石1.0%、CaCO30.8%,其采用的底物均為易得的富含淀粉類的農副產品。Syu等[43]對一株產α-淀粉酶的B.amyloliquefaciens(ATCC 23350,CCRC 10268)的發酵結果的分析顯示:以葡萄糖為碳源時,細菌生長速度很快,而以麥芽糖為碳源時能夠獲得相對較高的生物量、酶活力和產酶效率。李習[44]通過正交實驗對B.licheniformis BG14的培養基進行了優化,采用黃豆粉0.7%、麩皮1.0%、可溶性淀粉0.5%、蛋白胨1.0%、K2HPO40.5%作為發酵培養基,結果顯示:該菌在優化后的發酵培養基中所產耐高溫α-淀粉酶的活力達到334.32 U/mL,比初始發酵培養基的酶活力提高43.09%。范如意等[15]優化了B.licheniformis CBBD302產高溫α-淀粉酶的發酵培養基底物,將碳氮源由乳糖和豆餅粉改為木糖和豆餅粉,提高了其產酶量。表1顯示了其他部分芽胞桿菌屬菌株在液體發酵培養基中使用的培養基底物及其酶活產量,為研究者對各類菌株選擇相對應的底物提供參考。從表1中可知,大多數培養基配方使用淀粉類作為液體培養基中的主要底物和主要碳源。

不同菌種的溫度、pH、通氣量、溶氧和水分等發酵參數有很大的差異,研究者需要結合選用的菌株、發酵設備、產地氣候及生產成本等方面綜合進行考慮。例如:對于解淀粉芽胞桿菌這類好氧菌,發酵生產過程中通氣十分重要。研究表明,如果在3 L攪拌罐生物反應器中增加1 vvm的通氣量,解淀粉芽胞桿菌所產淀粉酶的活力將增加至2倍[45]。一般來說,較低的攪拌速度對解淀粉芽胞桿菌的α-淀粉酶的合成會更有利[46]。此外,在大規模發酵罐生產中,消除氣泡也是一個關鍵因素。尤其在菌體生長期和產物合成期,消除泡沫更為重要,否則極易造成漫灌跑液、染雜菌、降低產量等一系列不利影響[47]。

3.2 α-淀粉酶的固態發酵

固態發酵被定義為在沒有或幾乎沒有游離水的情況下發生的發酵過程,適用于生長過程中對水分要求較低的微生物[56]。它在生物浸出、生物選礦、生物修復、生物制漿等過程中均有應用,有著許多的優點,如:較高的發酵生產率、產品最終濃度和產品穩定性;較低的代謝抑制率;對發酵過程無菌性要求較低;設備要求簡單;廢料可再利用;污水產生少等[4]。雖然傳統上SmF一直用于工業生產酶制劑。但隨著SSF反應器設計的不斷改進,具有優化生產參數的SSF對進一步提高淀粉酶產量具有巨大的潛力。吳大治等[3]針對B.amyloliquefaciens BF7658的一株變異菌種,直接以麩皮為原料的固態發酵法生產α-淀粉酶。其采用的初始條件為:培養基初始含水量60%,起始pH自然,液體接種量5 mL/kg,37～39℃下發酵48～60 h。結果顯示:SSF法產α-淀粉酶的水平為SmF法的4～5倍,并且成本更加低廉。α-淀粉酶生產菌株B.licheniformis M27在含有15%葡萄糖的液體培養基中發酵培養后,其發酵液酶活為19.550 U/mL,而該菌在以相同百分比(150 mg/g)的小麥麩皮作為固態培養基進行發酵后,其酶活水平為1 450 U/gds(每克初始干物質)[57]。在SSF的固態培養基中,麥麩似乎是許多α-淀粉酶生產研究者首選的基質。表2列舉了其他一些菌株使用相應的農業副產物、廢棄物作為底物,進行SSF生產所得α-淀粉酶的酶活。表2表明:除麩皮外,其他農業廢棄物如香蕉皮、土豆皮、胡瓜皮、香蕉殘穗,以及在農產品加工過程中產生的殘渣如米糠、蔗渣、花生油渣、扁豆殼等,都是SSF產α-淀粉酶的有效底物。此外,SSF的成功很大程度上取決于控制合適的活化期、接種量、水分含量和pH等條件,這些參數對于不同菌種的差異性較大,需要研究者針對所選用菌株進行相關探索。

3.3 無機鹽等微量組分對α-淀粉酶產量的影響

磷酸鹽在微生物的一級和二級代謝產物的合成中起重要作用,會影響到微生物的生長和α-淀粉酶的產量。根據不同菌體生長及產酶需要,磷酸鹽的添加量也略有差異[64]。例如:李志鵬[2]在搖瓶水平進行B.amyloliquefaciens YL1-5的發酵培養時,添加了0.5%Na2HPO4和0.45%NaH2PO4,既為菌株提供了適量的磷酸鹽,也對發酵液的pH起到了緩沖作用。一般地,低濃度的磷酸鹽會導致芽胞桿菌的細胞濃度降低,酶合成延滯,而高濃度的磷酸鹽在芽胞桿菌產酶過程中也會降低α-淀粉酶的產量[42]。

通常,培養基中CaCl2和MgSO4的添加會增加 α-淀粉酶的產量,而且 Mg2+、Ca2+、Na+對 α-淀粉酶的產量和酶活發揮主要作用[65]。其中,除少數Ca2+非依懶型α-淀粉酶外,Ca2+對工業生產的α-淀粉酶的穩定性起到關鍵作用[66]。例如:在上述報道的解淀粉芽胞桿菌和地衣芽孢桿菌的發酵培養基中,均添加了少量Ca2+,分別為1.6%的CaCO3和 0.3%的 CaCl2[2,15]。

一般認為,培養基中的肌醇、D-山梨糖醇等單糖及吐溫80、Triton X-100等洗滌劑會抑制淀粉酶的產量,而其他的無機和有機鹽如KCl、蘋果酸鈉和琥珀酸鉀等則有利于淀粉酶產量增加。此外,在培養基中加入氨基酸如異亮氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸也被發現對淀粉酶生產至關重要[67]。

表1 液體深層發酵中部分芽胞桿菌屬菌株所產α-淀粉酶的酶活Table 1 Bacillus spp.α-amylase activity in SmF

表2 固態發酵中部分芽胞桿菌屬菌株所產α-淀粉酶的酶活Table 2 Bacillus spp.α-amylase activity in SSF

4 結語

誘變育種產生突變的位置是隨機的,該方法具有高度不確定性。短時間內使用誘變育種難以大幅度提高酶的活力,需要反復進行大量的篩選工作才能獲得較理想的突變菌株?；蚬こ屉m然能通過精確修飾改造微生物,但要求的技術難度較高,且對于一些來源不明的外源基因需要進行嚴格審查。研究者們應該結合菌種的實際情況,選擇相應的誘變或基因工程改造手段,以獲得生產產能更高、耐受性更強的α-淀粉酶生產菌株。在芽胞桿菌屬α-淀粉酶發酵工業中,發酵培養基底物的選擇對α-淀粉酶的發酵生產起著至關重要的作用。其中,新興的固體發酵法在產α-淀粉酶過程中能夠更好地利用農業及農產品加工過程中的廢棄物作為發酵培養基,是一種既高能效又環境友好的生產方式。此外,發酵工藝參數等細節的改良也能夠提高α-淀粉酶的產量。

隨著科技的進步、工業的發展,以及國家對環境保護的重視,淀粉酶在發酵、食品、糧食加工、造紙、紡織等輕工業的運用更加廣泛。未來對不同酶學性質的α-淀粉酶也將有更廣泛的需求,通過尋找極端環境微生物中新的α-淀粉酶編碼基因或者通過生物信息學預測并改造已有的基因序列是開拓新型α-淀粉酶市場、開發新應用領域的有效途徑。此外,雖然α-淀粉酶發酵產業已經較為成熟,但其下游工藝(酶的分離、純化等)仍占據著主要生產成本。通過構建缺陷性(如:蛋白酶缺陷性)或良好的選擇性通透型菌株以產生純度更高的發酵液,或者完善下游分離產業工藝,是解決該問題的主要途徑。相信隨著生產成本的降低和應用領域的拓展,α-淀粉酶將在國民經濟中發揮更大作用。