細胞自噬在個體發育和腫瘤發生中的作用

李國輝,李 東,祁馨宇,邱立鵬,唐 琦

(江蘇大學生命科學研究院,中國江蘇鎮江212013)

1963年比利時細胞生物學家Christian de Duve在細胞分級分離時首次發現溶酶體,并于1974年與Albert Claude及George E.Palade一起榮獲諾貝爾生理或醫學獎[1～2]。細胞自噬(autophagy)就是通過細胞中產生的自噬體與溶酶體膜間的融合,進而利用溶酶體中的蛋白酶將自噬體中包裹的蛋白質或細胞器進行降解,其不同于泛素-蛋白酶體系統的選擇性降解機制。該開創性工作是在單細胞生物酵母中完成的,其發現者為日本細胞分子生物學家Yoshinori Ohsumi(大隅良典),2016年諾貝爾生理或醫學獎獲得者[3～4]。細胞自噬是廣泛存在于從酵母、線蟲、果蠅到高等脊椎動物細胞中的一種維穩機制,在進化上具有高度保守性,其利用溶酶體中的各種水解酶對胞內蛋白質聚集體或折疊錯誤的蛋白質、受損的細胞器以及入侵的病原體等進行降解并回收利用[5～7]。細胞自噬異常與疾病的發生發展緊密相關,如腫瘤細胞的惡性增殖、神經退行性疾病等[8～10]。

細胞自噬是一種區別于泛素-蛋白酶體系統的降解途徑。根據細胞內含物進入溶酶體腔方式的不同,細胞自噬可分為巨自噬(macroautophagy)、分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)和微自噬(microautophagy)3 種(圖 1)[11～13]。巨自噬是目前研究最為深入的一種細胞自噬方式,該過程涉及到吞噬泡的形成、自噬體的產生以及自噬體和溶酶體間的膜融合,最后形成自噬溶酶體,將其包裹的蛋白質聚集體或發生錯誤折疊的蛋白質進行降解[12～13]。分子伴侶介導的自噬包括分子伴侶對底物的識別、結合,并作用于溶酶體相關膜蛋白2A(lysosome-associated membrane protein 2A,LAMP-2A),隨后在LAMP-2A復合物的作用下,將靶蛋白轉位到溶酶體內進行降解。微自噬就是通過溶酶體直接將胞內折疊錯誤的蛋白質包裹進來,然后在溶酶體中對其進行降解[12～13]。

圖1 三種類型的細胞自噬示意圖(1)巨自噬能將錯誤折疊的蛋白質或蛋白質聚集體包裹起來形成自噬體,通過膜融合的方式介導溶酶體對其進行降解;(2)分子伴侶介導的自噬指的是含降解信號序列的蛋白質分子與熱休克關聯蛋白質分子發生結合,進而在胞質中招募分子伴侶并與溶酶體膜蛋白LAMP-2A結合,誘導其發生寡聚化,從而介導待降解蛋白質分子的轉位和降解;(3)微自噬是指直接通過溶酶體對胞質中的一些蛋白質進行包裹并對其進行降解。Fig.1 Illustration of three types of autophagy(1)Macroautophagy is generally regarded as autophagy.In the process,double-membrane vesicles enclose some protein aggregates and misfolded proteins that are subsequently degraded after fusion with lysosome;(2)The chaperone-mediated autophagy is the degradation pathway for the target protein containing degradation signal.After proteins binding to LAMP-2A on lysosomes,they are translocated from cytosol into lysosome for degradation;(3)Microautophagy directly engulfs cytoplasmic components for degradation.

當遭受營養饑餓、組織缺氧、藥物化療和氧化應激等外界刺激時,細胞會被誘導產生自噬來進行自我保護,同時利用降解產生的氨基酸和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)來提供胞內蛋白質合成和細胞代謝所需的成分[14]。到目前為止,已在酵母和哺乳動物細胞中鑒定了40多個自噬相關基因(autophagy-related gene,Atg)。酵母中每個Atg基因的編碼產物只有一種蛋白質形式,而哺乳動物細胞中一些Atg基因的編碼產物卻有多種異構體形式,這些蛋白質在自噬體的起始合成、蛋白質靶標的識別、自噬泡的延伸和自噬體與溶酶體膜間融合等過程中都發揮作用[15]。研究發現細胞自噬與人類疾病的發生發展密切相關。細胞自噬能降解胞內一些蛋白質聚集體,維持神經元的正常功能,一旦這些功能紊亂就容易引起老年癡呆、帕金森病、亨廷頓病等多種神經退行性疾病和人體自身免疫疾病的發生[16～18]。此外,細胞自噬與機體先天免疫和后天獲得性免疫活性相關[19]。本文對細胞自噬形成的基本過程、分子調控機制及其在個體發育與腫瘤發生之間的關系進行綜述,可為深入研究細胞自噬分子機制提供參考,并為人類疾病治療提供新的靶點。

1 細胞自噬的發生與調控

細胞自噬活性不足或過度對機體的正常代謝都是有害的,因此,其生物活性在機體內受到嚴密監視和調控。目前,人們已在酵母、果蠅和哺乳動物細胞中對細胞自噬的誘導及調控進行了廣泛深入的研究,其中TORC1和Ras/PKA等信號途徑主要調控細胞自噬的活性水平。細胞自噬的動態過程可以人為地分為誘導、靶標識別、包裹、膜泡成核、膜泡延伸、Atg蛋白循環利用、與溶酶體膜融合、靶標發生降解和降解后組分的回收利用等幾個主要階段[20]。細胞自噬形成過程中最典型的一個生物學特征就是能夠形成具有雙層膜的運輸泡,該囊泡在形成過程中受Atg蛋白的調控,依據這些調控蛋白質的差異可將其分為選擇性的細胞自噬和非選擇性的細胞自噬[21]。選擇性的細胞自噬是通過自噬泡上受體蛋白質的特異性介導,將靶標包裹入囊泡中并對其進行降解;而非選擇性的細胞自噬就是胞質中的靶標被隨機性地包裹入自噬泡中并對其進行降解。

細胞自噬發生過程非常復雜,其囊泡不同于出芽方式產生的運輸小泡,該過程牽涉到許多蛋白質的參與及調控,并在自噬泡組裝位點(phagophore assembly site,PAS)形成自噬泡直至成熟。2013年,Hamasaki等[22]報道PAS介于內質網膜與線粒體膜的接觸位點?，F以巨自噬為例簡要介紹自噬泡形成的過程[23～25]:在外部壓力(如營養缺乏)條件下,哺乳動物雷帕霉素復合物1(mTORC1)失活,其下游的作用靶標ULK1/ULK2 (酵母中對應的是Atg1蛋白)復合物去阻遏,激活后的ULK1/ULK2復合物能作用于第Ⅲ類磷脂酰肌醇3激酶(PtdIns3K)復合物,該復合物包括Beclin 1(酵母中同源蛋白為Atg6)和VPS34(液泡分選蛋白34),當Beclin 1序列中Ser14發生磷酸化后,可促進PtdIns3K發生磷酸化產生PtdIns3P分子,并激活VPS34蛋白的生物活性,這一系列誘導都能被細胞自噬早期效應分子如Atg21和WIPI1/2 (酵母中為Atg18)等識別,并在PAS位點啟動自噬泡的發生。

在酵母中,細胞自噬核心分子包括兩個泛素樣的蛋白質Atg8和Atg12,它們在Atg7激活之后,能介導自噬泡體積的變大。研究表明Atg8蛋白高度保守,酵母中只含有單個Atg8基因,其蛋白質產物C末端甘氨酸殘基與脂質磷脂酰乙醇胺偶聯,定位于酵母自噬泡表面,而N-端的螺旋結構能介導自噬體與溶酶體膜間融合,是自噬體形成非必需的,但能調控自噬體的顆粒大小;Atg12能招募并形成Atg12-Atg5-Atg16復合物,該復合物在Atg9蛋白的幫助下能正確定位到PAS 位點[26]。2017 年 Maeda 等[27]報道,Atg8 蛋白在細胞靜止狀態下也能夠降解一定量的脂滴,但是當Atg8基因突變或缺失時則不會有此功能,表明Atg8蛋白具有不依賴細胞自噬途徑來維持細胞中脂滴動態的活性。在哺乳動物細胞中,Atg8同源蛋白統稱為微管蛋白1輕鏈3(light chain 3,LC3),分為兩個亞家族,由6種蛋白質組成,其中LC3B(light chain 3B)蛋白研究最為廣泛,與自噬體的組裝和成熟有關,可決定自噬體中被包裹進來的蛋白質的特異性,同時可調控自噬體的大小。LC3B蛋白通常被用作細胞自噬活性的一個監測指標,為細胞自噬研究提供了一個有效的標記[13,28～29]。

2 細胞自噬在免疫系統方面的作用

細胞自噬在胞內病原體的去除、胞內分泌途徑調控、淋巴細胞的發育和促炎癥信號等方面都起著重要的作用。機體可通過直接吞噬胞內病原體,或者利用膜蛋白受體如Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR),介導參與胞內病原體的吞噬,產生的囊膜小泡與溶酶體融合形成自噬溶酶體,從而對胞內病原體進行清除或者降解[30～31]。

吞噬過程中產生的囊泡與分泌途徑中的膜泡具有相似的結構和功能,因此,參與細胞自噬過程中的一些蛋白質可同時在吞噬作用和蛋白質分泌途徑中起作用。2012年Castillo等[32]報道,Atg5基因缺陷小鼠的巨噬細胞能高水平表達白介素IL-1α,從而導致過度的炎癥反應?？乖蔬f細胞中抑制細胞自噬會促進胞內IL-1β和IL-23分泌因子水平的升高;而脂多糖刺激會抑制胞內IL-1β 因子的分泌水平[33～34]。2016 年 Lee等[35]報道,細胞自噬調控線粒體中活性氧的水平,在巨噬細胞炎癥因子的分泌中起重要作用,胞內活性氧水平異常與多種疾病及腫瘤發生相關。

細胞自噬激活抗原呈遞細胞,可將外來抗原有效地呈遞在巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞的表面,從而影響淋巴細胞的發育。后天獲得性免疫途徑主要通過T淋巴細胞和B淋巴細胞發揮免疫作用,它們在發育過程中需要特定的激活,否則會導致人體自身免疫疾病的發生。T淋巴激活信號主要是通過一個主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)分子進行抗原呈遞。該復合體分為MHCⅠ和MHCⅡ兩類,其中MHCⅠ主要存在于有核的細胞中,而MHCⅡ存在于巨噬細胞、樹突狀細胞和B淋巴細胞中。胞內或胞外的一些蛋白質需要通過泛素降解途徑或者細胞自噬進行降解,產生的肽段抗原才可呈遞在細胞表面[36]。在巨噬細胞感染過程中,細胞自噬不僅能提高MHCⅠ分子呈遞病毒抗原的能力,而且也能促進MHCⅡ呈遞病毒抗原[37]。細胞自噬也是樹突狀細胞表面分子MHCⅡ與T細胞表面分子CD4結合所必需的;若樹突狀細胞中缺乏細胞自噬活性,則會降低MHCⅡ呈遞外來抗原的能力[38～39]。另外,細胞自噬也是維持漿細胞(也叫效應B細胞)動態穩定和長期體液免疫所必需的,細胞自噬缺陷或過度活躍都會對漿細胞的發育和功能產生影響,從而導致人體自身免疫疾病的產生[40]。

近年研究表明,細胞自噬與NF-κB信號通路激活相關。2012年Paul等[41]報道,細胞自噬銜接蛋白Bcl10可調控T細胞受體(TCR)介導的NF-κB信號通路激活(一種高度保守的胞內降解途徑)。2016年Zhong等[42]報道,胞內損傷線粒體的清除需要依賴細胞自噬銜接蛋白p62/SQSTM1,該蛋白質可調控NLRP3-炎性體的激活;若p62/SQSTM1發生缺失,則會導致炎性體和胞內IL-1β表達水平的增加。

3 細胞自噬可維持胞內蛋白質/細胞器動態平衡

胞內蛋白質合成與降解需要維持在一個動態平衡范圍內,其與細胞自噬和泛素-蛋白酶體系統兩條降解途徑直接相關:泛素-蛋白酶體系統主要負責降解生命周期短的蛋白質[43];細胞自噬則可批量降解胞內生命周期長的胞質蛋白質和細胞器。對于3種不同類型的細胞自噬,它們的區別在于其囊膜是特異性還是非特異性地包裹胞中的內含物。細胞自噬功能異?；蛘{控紊亂,容易導致人體各種疾病的發生[44～46]。

細胞自噬在功能正常的生理狀態下充當細胞管家,對胞內錯誤折疊的蛋白質、氧化損壞的蛋白質以及功能異常的細胞器等進行嚴密監視,及時清除蛋白質聚集體和功能異常的細胞器,這不僅可避免細胞過早死亡,也有助于細胞壽命的延長,提高機體的各項生理機能[47]。在哺乳動物中,細胞自噬能降解胞內形成的一些蛋白質聚集體,如神經元細胞中的突觸蛋白、突變的亨廷頓蛋白和tau蛋白,以及一些入侵的病原體如傷寒桿菌和結核桿菌等,從而降低神經退行性疾病和傳染性疾病的發生概率;同時,細胞自噬也能降解胞內功能異常的線粒體、過氧化物酶體、脂滴、核糖體和部分細胞核[48]。細胞在正常的生理狀態下,其自噬活性維持在一個正常的基礎水平,將胞內一些功能異常的蛋白質和細胞器去除,控制著胞內質控系統;而當細胞出現炎癥時,自噬活性急劇上調,從而維持胞內一個動態平衡[49]。隨著人和酵母中自噬基因的鑒定,科研人員發現它們不僅直接參與細胞自噬體的形成,而且與組織動態變化、抗衰老、細胞分化、發育、先天免疫、后天獲得性免疫、代謝疾病、心臟疾病、中風和造血功能缺陷等都有直接關聯[50～53]。由此可見,機體各種器官的退化和衰老與細胞自噬功能降低呈正相關,目前盡管對細胞自噬抗衰老的分子機制仍不甚清楚,但對細胞自噬途徑中相關靶分子進行調控或許是延長壽命的一種有效方式。

當機體處在紫外照射、營養饑餓和組織缺氧等逆境條件下時,細胞可以通過降解并回收利用自身蛋白質、脂類和碳水化合物等大分子物質,來提供機體生存所需要的基本成分和能量,是機體在環境不利的情況下做出的一種正常的反應[54～55]。當DNA發生損傷得不到及時修補,不斷累積在細胞中時,會導致細胞老化、死亡甚至癌變,而細胞自身可以通過DNA修補、細胞凋亡和細胞自噬等分子機制來抑制該級聯反應[56～57]。蛋白質的翻譯后修飾(如磷酸化、泛素化、乙?；椭|化)可快速誘導細胞自噬發生,如:腫瘤抑制因子p53的靶標蛋白DAPk(death-associated protein kinase),其能對Bcl-2序列上119位絲氨酸以及蛋白激酶D(protein kinase D,PKD)進行磷酸化,從而導致Vps34-PI3K復合物磷酸化,進而啟動細胞自噬的發生[58],直接將損傷的DNA進行降解,有效管控DNA損傷誘導的不利反應,維持細胞中DNA和蛋白質的代謝平衡。

4 細胞自噬影響個體發育

在一些模型生物中,人們發現細胞自噬缺陷會影響個體發育,如:酵母不能形成孢子、線蟲體細胞中P顆粒不能發生降解以及果蠅幼蟲致死和果蠅蛹變態發育成昆蟲受阻等[59]。在哺乳動物中,細胞自噬在心臟、骨骼及神經系統發育和細胞分化中起著重要作用,如:紅細胞來源于骨髓造血前體細胞,細胞自噬可對幼紅細胞中的線粒體、核糖體和其他細胞器進行降解,從而產生成熟的紅細胞,若自噬相關蛋白質功能異常,將會阻礙正常紅細胞的產生,從而產生貧血癥和其他血液疾病[60]。

在哺乳動物細胞中,細胞自噬對于胚胎發育、新生兒存活與器官發育都是非常重要的。哺乳動物受精后,細胞自噬與泛素-蛋白酶體系統協同降解精子中的線粒體,從而有助于線粒體DNA的異質性;受精卵發育到2個細胞之后,細胞自噬被高度激活,可降解母系來源的mRNA和蛋白質,這有助于合子基因組的活化[61～62]。Atg5基因缺失的小鼠胚胎在發育過程中不會超過8細胞階段;細胞自噬對新生小鼠發育有重要影響,這主要是來源于小鼠母系的胎盤營養供應出現中斷,使新生小鼠面臨嚴重的饑餓挑戰,而細胞自噬在乳汁喂養這個營養過渡期起重要的作用,神經功能缺陷和細胞自噬缺陷都會導致乳汁喂養失敗[63]。另外,細胞自噬還有利于去除老舊組織,在細胞命運決定時與細胞凋亡協同發揮作用。

在果蠅幼蟲變態發育過程中,其唾液腺的去除高度依賴細胞自噬介導的細胞死亡和細胞凋亡,然而中腸組織的降解僅依賴細胞自噬[64];在果蠅卵巢發育過程中,需要半胱天冬酶來誘導細胞發生自噬,而果蠅營養細胞的凋亡需要通過細胞自噬降解其凋亡抑制蛋白[65]。在大多數機體中,細胞自噬是一種重要的自我保護反應。為了說明細胞自噬是細胞死亡的主要原因,細胞自噬導致的細胞死亡也被稱為Ⅱ型細胞死亡,這意味著化學或遺傳上抑制細胞自噬的活性,細胞死亡也會受到抑制。細胞自噬能降解胞內的鐵蛋白,導致活性氧在細胞內積累,從而引起細胞死亡。這種細胞防御機制也叫異體吞噬,能夠選擇性地識別胞內微生物包括細菌、病毒和原生生物,從而把它們傳送到細胞自噬泡中進行降解[66]。

5 細胞自噬抑制腫瘤發生

細胞自噬是一種正常的生理生化過程,能清除機體中的一些異常細胞和胞內的異常蛋白質,對維持胞內組分的動態平衡和保障機體生存起重要作用。細胞自噬異常與人體許多疾病的發生發展密切相關,其中細胞自噬與抗腫瘤增殖活性的研究較為深入。

Yu等[67]報道,異喹啉類生物堿小檗堿(berberine)能上調原發性肝癌細胞中Beclin-1和LC3蛋白的表達,誘導細胞凋亡和細胞自噬來殺死肝癌細胞,從而抑制腫瘤細胞的遷移和發展。另外,通過對抗細胞凋亡的細胞系進行生物堿處理,結果發現在處理后的細胞中,細胞自噬流和細胞自噬體數量顯著增多,同時胞內AMPK-mTOR途徑也被激活,進而殺死這些細胞[68]。粉防己堿(tetrandrine)是一種草本植物根部的生物堿提取物,同時也是一種廣譜有效的細胞自噬激動劑。Wang等[69]報道,低劑量的粉防己堿不會影響細胞的活力,但會誘導非小細胞肺癌A549細胞系、人前列腺癌PC3細胞系、乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞系、神經膠質瘤U87細胞系和宮頸癌HeLa細胞系中細胞自噬的發生,從而引發細胞死亡。另外,一些生物堿如苦參堿、槐果堿、槐定堿、氧化苦參堿、苦豆堿和金雀花堿都具有抗腫瘤生物活性,它們能夠誘導一些腫瘤細胞如人白血病細胞系K562、U937和HL-60以及癌細胞系EC109、A549和HeLa發生細胞自噬,抑制腫瘤細胞的增殖,而且這種抗腫瘤效果與生物堿濃度呈正相關[70]。這些研究表明:臨床上可以通過生物堿或其類似物對腫瘤進行治療,誘導胞內發生細胞自噬來殺死腫瘤細胞,達到根除腫瘤的治療效果。目前,已在人體多種腫瘤中發現細胞自噬異常的現象,其功能異常有利于腫瘤細胞的惡性增殖和遷移,說明細胞自噬在維持正常細胞生命活動和殺死異常細胞方面具有重要的作用。由此可見,將來有望在臨床上通過激活細胞自噬途徑,為腫瘤患者提供可行、有效的治療方案。除此之外,細胞自噬還與神經退行性疾病、肝臟疾病、心力衰竭、糖尿病、肥胖癥和自身免疫性疾病等多種疾病和炎癥密切相關[12,71]。

6 小結與展望

細胞自噬是胞內的一種降解途徑,與胞內物質代謝平衡、細胞存活和機體發育等生物過程都密切相關。細胞自噬功能異常會導致多種人類疾病的發生,已有報道顯示許多重大疾病都與細胞自噬功能異常相關。盡管細胞自噬在過去20年里取得了巨大的進展,揭示了細胞自噬主要是通過溶酶體途徑對功能異常的蛋白質和損傷的細胞器進行降解,然而我們對細胞自噬的認識仍停留在初級階段,如自噬體膜的來源以及胞內來源的膜組分如何融入到自噬體膜中等科學問題仍不清楚,這些都有待于我們進一步去闡明。此外,在細胞自噬發生過程中,許多與細胞自噬相關的蛋白質都發生了翻譯后修飾,然而這些修飾方式如何調控細胞自噬的活性也不甚清楚,或許通過揭示細胞自噬相關蛋白質的空間結構及其相互之間的作用,有助于闡明這些科學問題,從而為深入揭示細胞自噬在人體疾病中的發生和調控機制提供理論依據。