熱應激對豬PBMC中NOD樣受體及炎性因子mRNA轉錄水平的影響

李俊玉，雍艷紅，方 彪，于天月，吳蓮云，巨向紅,3*

(1.廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518108；2.廣東海洋大學 動物醫學系，廣東 湛江 524088；3.廣東海洋大學 動物科學系，廣東 湛江 524088)

熱應激是指處于極端高溫環境中的動物機體，表現出的熱喘息、免疫力下降、心力衰竭、代謝加快等非特異性生理反應的總和。而熱應激也已經成為我國南方地區應激性致病因素中危害最大的一種，給養殖業造成了重大的經濟損失[1]。熱應激豬出現生長緩慢、免疫力下降及對疫病的敏感性增高等現象[2]。本研究前期研究顯示，熱應激能夠顯著上調豬 Toll 樣受體家族中的 TLR2、TLR4 和 TLR4選擇性剪切體的表達[3]，炎性因子 IL-2、IL-12 和IFN-γ 的表達也發生改變，出現嚴重的炎性因子紊亂[4]，從而激活機體的免疫系統。

核苷酸結合寡聚化結構域蛋白(Nucleotide binding oligomerization domain-containing protein，NOD)樣受體家族(NOD-like receptors，NLRs)屬胞漿內模式識別受體家族[5]，參與信號傳導的調控，在免疫應答過程中發揮重要作用。目前確定的哺乳動物NLRs 有 23 種，其中 NOD1 和 NOD2 是 NLRC 亞型中最重要的 2 種胞漿受體。研究表明，NOD1/2 與配體結合后，其構象發生變化，與下游受體作用蛋白 2 (Receptor- interacting protein 2，RIP2)相互作用使 IκB 磷酸化，從而激活核轉錄因子 NF-κB，介導炎癥介質的表達[6]。NOD 還能夠作用于半胱天冬酶，介導細胞凋亡或相關細胞因子的表達[7]。

作為胞漿內模式識別受體家族的重要成員，NOD1/2 在各種病原體的感染和固有免疫過程中均起著重要的作用，是近幾年免疫學研究的熱點。Sengar 等研究顯示，在體外急性熱應激牛外周血單核細胞(PBMC)和MDBK 細胞模型中檢測到NOD1/2表達上調[8]。因此，深入探究熱應激條件下NOD 樣受體與炎性因子的表達規律，將有助于闡述其在熱應激致病中的作用機制。鑒于此，本研究檢測了熱應激不同時段豬 PBMC 中 NOD1、NOD2 及部分炎性因子的轉錄水平變化，為系統闡述NOD 樣受體在熱應激致病中的作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12 頭 2月齡(體重為 15±1 kg)的土雜豬(雷州黑豬♀×杜洛克♂)飼養于廣東海洋大學農學院實驗動物中心。適應兩周后，實驗豬被隨機分為兩組，對照組和熱應激組。對照組常規飼養，環境溫度為 20±2 ℃，相對濕度 80 %～85 %。熱應激組飼養于環境溫度為35±1℃的人工氣候溫室，相對濕度80 %～85 %。以全價飼料(大北農農牧科技有限公司，小豬料)飼喂，每日早、中、晚各一次，自由飲水。分別在熱應激的第 0、7 d、14 d 和 21 d 采集豬外周血備用。

1.2 主要試劑 豬淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A)、TB GreenTMPremix ExTaqTMII (Tli RNaseH Plus) (RR820A)、DL2000 DNA Marker (3427A)、SYBR Green I熒光定量PCR檢測試劑盒均購自TaKaRa 公司；核酸染料購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂粉購自Sigma 公司。

1.3 引物的設計與合成 根據GenBank 中登錄的豬 NOD1/2及炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-1β、內參基因 GAPDH 的序列，利用 Premier 5.0 軟件設計擴增引物(表1)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 引物序列及產物長度Table 1 Primer sequence and product size

1.4 實驗豬PBMC 總RNA 的提取及反轉錄 分別于熱應激的第 0、7 d、14 d 和 21 d，經前腔靜脈采集實驗豬外周抗凝血，按照豬外周血淋巴細胞分離試劑盒說明書分離其PBMCs。TRIzol 法提取PBMC的總RNA 后，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，酶標儀檢測 OD260nm/OD280nm比值，大于 1.8～2.0 的樣品凍存于-80 ℃冰箱備用。同時將其反轉錄為cDNA，保存在 -20 ℃冰箱。

1.5 實驗豬PBMC 熒光定量PCR(qPCR)的檢測按照 SYBR Green I qPCR 檢測試劑盒說明書，以PBMCs 反轉錄后的cDNA 為模板，以表1 中的各對引物，qPCR檢測NOD1、NOD2及炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 和 IL-1β mRNA 的轉錄水平。反應條件為：95 ℃ 35 s；95 ℃ 20 s、58 ℃35 s、72 ℃ 20 s、共 40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min；95 ℃ 15 s，溫度每升高 0.2 ℃采集熒光一次。

1.6 數據分析 采用相對定量，通過計算 2-ΔΔCt值求出目標基因在PBMC 中的相對轉錄水平，ΔΔCt=(目的基因 Ct - 管家基因 Ct)試驗組-(目的基因 Ct - 管家基因Ct)對照組，將對照組中不同時間點PBMC 所得數據進行歸一化處理，處理組以對照組的倍數表示作圖。采用SPSS 20.0 軟件進行顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01 表示差異極顯著。多重線性回歸分析 NOD1/2 與 TNF-α、IFN-γ 等 6 種細胞炎性因子之間的相關性。

2 結 果

2.1 q PCR 方法的建立 采用SYBR Green I qPCR法檢測各目標基因的轉錄水平，對目標基因的擴增曲線、熔解曲線觀察發現，熱應激不同時段豬PBMC各目標基因的擴增曲線均為標準的“ S”形(圖1)，且間距均勻。熔解曲線均為特異的單峰(圖2)，且起峰時間一致，表明引物特異性較好，產物純度高，沒有受到污染，定量結果相對穩定，結果可信。

圖1 目的基因qPCR的擴增曲線Fig.1 Amplification curves of target genes detected by qPCR

圖2 目的基因qPCR的熔解曲線Fig.2 Melting curves of target genes detected by qPCR

2.2 熱應激豬 PBMC 中 NOD 樣受體 mRNA 轉錄水平的變化 與對照組相比，應激組實驗豬PBMC中NOD1 和NOD2 mRNA 轉錄水平在熱應激處理的第7d顯著上調(p＜0.05)，在第14d極顯著上調(p＜0.01)，但在熱應激處理的第21d顯著下調(p＜0.05) (圖3)。表明在熱應激處理過程中 NOD 樣受體mRNA 的轉錄水平發生了顯著的變化，推測其可能參與了豬的熱應激調節過程。

圖3 熱應激豬外周血淋巴細胞中NOD1/2mRNA轉錄水平的檢測結果Fig.3 The mRNA transcriptional level of NOD1/2 in PBMCs of heat-stress pigs

2.3 熱應激豬PBMC 中炎性因子mRNA 轉錄水平的變化熱應激條件下，豬PBMC 中 TNF-α 和IFN-γ mRNA 轉錄水平在熱應激第 7 d、14 d 和 21 d極顯著上調(p＜0.01)。IL-10 mRNA 的轉錄水平在熱應激第7 d 較對照組豬降低，但在第14 d 和第21 d極顯著上調(p＜0.01)。IL-1β mRNA 的轉錄水平在熱應激的第 7 d 和第 14 d 極顯著上調(p＜0.01)，但在第 21 d 時該轉錄水平極顯著下調(p＜0.01)。IL-6 mRNA 轉錄水平在熱應激的第7 d 顯著上調(p＜0.05)，但在第21d該轉錄水平極顯著下調(p＜0.01) (圖4)?？梢姛釕ひ鹆?PBMC 中炎性因子的顯著變化。

圖4 熱應激豬外周血淋巴細胞中炎性因子mRNA轉錄水平的檢測結果Fig.4 The mRNA transcriptional levels of inflammatory cytokines in PBMCs of heat-stress pigs

2.4 PBMC 中NOD1/2 與炎性因子的相關性分析熱應激豬PBMC 中NOD1/2 mRNA 水平與相關炎性因子多重線性回歸分析顯示，與對照組相比，應激組實驗豬 PBMC 中 NOD1 與炎性因子 IFN-γ 和 IL-10之間相關系數較高，分別為0.991、0.899, NOD2 與炎性因子IFN-γ 和IL-10 相關性也較高，相關系數分別為 0.991 和 0.932。由此表明 NOD1/2 的上調均與炎性因子IFN-γ 和IL-10 存在正相關。

3 討 論

應激與免疫之間的關系是通過神經內分泌系統聯系在一起的。應激引起下丘腦 - 垂體 - 腎上腺(HPA)軸反應, 導致各種激素(例如 CRH、GC、ACTH 等)分泌亢進[9]，而這些激素又作用于各種細胞因子，從而使得應激與機體的免疫功能緊密聯系在一起。由于高溫的作用，熱應激比普通的應激更為復雜。

NODs 作為固有免疫的胞質受體，能夠識別病原體病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，在宿主防御病原體的過程中起關鍵作用。NOD1/2 與相應的配體識別后可以激活下游信號通路，如NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases，MAPK)信號，導致促炎因子分泌，并通過級聯反應放大炎癥反應，最后清除病原菌。Yan 等研究顯示，熱應激通過激活capase-1 和NOD 樣受體家族組成的炎性小體最終造成小鼠肝損傷[10]。本研究通過qPCR 檢測顯示，在熱應激的前期，NOD1 和NOD2 mRNA 轉錄水平顯著上調，這表明NOD 樣受體轉錄水平的升高是熱應激對機體免疫系統早期的主要反應。但誘導NOD上調的分子機制還需進一步研究。

炎癥反應是機體對外來刺激產生的一種病理性反應過程。一些細胞因子能夠顯著促進炎癥反應的發生，如IL-1、IL-6 和 IL-8 等可以直接刺激中樞系統引起體溫升高，促進炎癥細胞的聚集、活化和炎癥介質的釋放[11]。胡艷欣等研究顯示熱應激處理第1 d 和 3 d 時豬血清中 IL-2 水平顯著上升，TNF-α 水平也隨之上升[12]。研究顯示熱應激狀態下，小鼠血液中 IL-1β、TNF-α、IL-6 等炎性因子的含量會急劇升高，最終導致機體多器官功能損傷[10,13]。本研究顯 示 豬 PBMCs 中 TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6、IFN-γ 等 mRNA 轉錄水平在熱應激的第 7 d 和 14 d顯著上調，推測熱應激誘發了機體的炎性過程。

NOD 樣受體是機體重要的胞內識別受體，在熱應激條件下顯著升高。相關性分析顯示，其與炎性因子 IFN-γ 和 IL-10 的變化呈正相關。推測熱應激條件下 NOD 被激活，經一系列的級聯反應，激活了NF-κB 或MAPK 信號通路，介導了炎性因子的上調。但有關熱應激條件下NOD 受體與炎性因子調控的確切機制還需進一步的研究。